超嗜熱酯酶ape1547穩(wěn)定性研究

超嗜熱酯酶ape1547穩(wěn)定性研究

酯酶是一種能夠加速和分解酯鍵的水解酶，通常存在于動(dòng)植物和微生物中。許多酯酶在水溶液和非水平中具有加速反應(yīng)的功能，因此是工農(nóng)業(yè)中應(yīng)用最廣泛的酶之一，可以促進(jìn)三維選擇性水、酯和酯的合成和反應(yīng)。由于低溫酶穩(wěn)定性低，一般無法適應(yīng)高溫、有機(jī)溶劑等工業(yè)反應(yīng)條件。因此，提高酶穩(wěn)定性是當(dāng)前生物工程研究的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)在，主要通過從高溫菌中直接分離熱酶，然后通過蛋白質(zhì)工程方向改變自然酶的分子。根據(jù)第一種研究，后者比五種熱酶有許多優(yōu)點(diǎn)。它對高溫、堿、堿、鹽和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化具有良好的抗性。它克服了熱酶在高溫下失去活動(dòng)的缺點(diǎn)。同時(shí)，對耐熱酶結(jié)構(gòu)和功能的研究有助于闡明耐熱酶的冷熱機(jī)制，為定向轉(zhuǎn)化自然酶提供理論依據(jù)。耐熱酶通常還具有耐有機(jī)溶劑及變性劑等特性,因此更有工業(yè)應(yīng)用的潛力.耐熱酯解酶已用于合成生物多聚物,生產(chǎn)藥物、化妝品和香料.目前,已有十幾種來自于嗜熱菌及超嗜熱菌的嗜熱酯酶/脂肪酶被克隆表達(dá),它們的最適反應(yīng)溫度都在60℃以上,如來自嗜熱細(xì)菌(Alicyclobacillusacidocalarius)的嗜熱酯酶最適反應(yīng)溫度為70℃,來自嗜熱古細(xì)菌(Archaeoglobusfulgidus)的酯酶最適反應(yīng)溫度為80℃,而且都有很好的熱穩(wěn)定性.我們實(shí)驗(yàn)室克隆的來自超嗜熱古細(xì)菌(AeropyrumpernixK1)的超嗜熱酯酶APE1547的最適反應(yīng)溫度為90℃,是目前發(fā)現(xiàn)的最適反應(yīng)溫度最高的酯酶之一.本文主要研究該酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑穩(wěn)定性.1實(shí)驗(yàn)部分1.1熒光分光光度計(jì)日立UV-557紫外-可見分光光度計(jì);島津RF-5301PC熒光分光光度計(jì).NileRed、對硝基苯酚辛酸酯和Tris均購自Sigma公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純.1.2殘余酶活力的測定按照文獻(xiàn)的方法,選擇不同質(zhì)量濃度(0.8,0.4,0.2和0.04mg/mL)的酶置于30mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中,在90℃水浴中保溫不同時(shí)間,取樣測定殘余酶活力.按照文獻(xiàn)的方法測定熱變性時(shí)表面疏水氨基酸的變化.1.3ph穩(wěn)定性將超嗜熱酯酶APE1547(終質(zhì)量濃度0.1mg/mL)在不同pH的緩沖液中于室溫分別放置1和24h,測定殘余的酶活力.1.4有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性將按文獻(xiàn)方法處理過的酶粉溶于50mmol/LTris-HCl(pH=8.0)中,于室溫放置4h,按標(biāo)準(zhǔn)測活方法測殘余活力.1.5酶活力測定按照文獻(xiàn)的方法,于70℃用日立557型紫外分光光度計(jì)測定405nm的光吸收值.1個(gè)酶活力單位是1min水解底物生成1μmol對硝基苯酚所需要的酶量.2結(jié)果與討論2.1酶活力的變化將不同濃度的超嗜熱酯酶APE1547于90℃保溫為一級失活的過程.表1列出了熱變性時(shí)的速率、半衰期及自由能的變化.隨著蛋白濃度的增加,熱失活的速率常數(shù)、半衰期及自由能都隨之增加.熱失活的自由能ΔG值隨著酶濃度的增加而增加,這預(yù)示著對溫度敏感形式的酶隨著蛋白濃度的增加而減少,酶的濃度越高越穩(wěn)定.這說明該酶的熱穩(wěn)定性與酶濃度緊密相關(guān).酶的質(zhì)量濃度為0.2mg/mL時(shí),該酶在90℃的半衰期達(dá)到了12h.而來自嗜熱細(xì)菌(Alicyclobacillusacidocalarius)和嗜熱古細(xì)菌(Archaeoglobusfulgidus)的嗜熱酯酶在90℃時(shí)的半衰期僅為18和28min,表明超嗜熱酯酶APE1547是目前最適反應(yīng)溫度高、熱穩(wěn)定性好的酯酶之一.為了研究酶在高溫下活力與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,我們考察了酶在90℃熱失活時(shí)疏水氨基酸的變化.從圖1(A)可見,內(nèi)源熒光的熒光強(qiáng)度隨著酶活力的逐漸降低而降低,在殘余酶活力大于90%時(shí)最大發(fā)射波長沒有發(fā)生移動(dòng),當(dāng)酶活力損失20%以后熒光強(qiáng)度明顯降低,而且最大發(fā)射波長發(fā)生紅移,從336nm逐漸移到了345nm;從圖1(B)可以看出,熱失活的蛋白與NileRed結(jié)合后,同樣在殘余酶活力大于90%時(shí)的熒光強(qiáng)度和最大發(fā)射波長都沒有發(fā)生明顯的變化,而殘余酶活力小于80%時(shí),最大發(fā)射波長明顯藍(lán)移,從640nm(沒有結(jié)合染料)逐漸移到590nm(結(jié)合染料的熱失活蛋白),而且熒光強(qiáng)度明顯增加.NileRed在緩沖液中以及在含有蛋白的緩沖液中的最大激發(fā)波長一致,并且熒光強(qiáng)度都很小.由此可見熱失活的進(jìn)行伴隨著疏水氨基酸逐漸地暴露到溶液中.疏水氨基酸的暴露使蛋白質(zhì)分子疏水區(qū)容易接觸,并使分子聚集,導(dǎo)致了超嗜熱酯酶APE1547失活,形成的沉淀是不可溶的,因此熱變性失活也是不可逆的.2.2s1547在酸性條件下不穩(wěn)定,ph值對酶活力的影響將0.2mg/mL酶在不同pH的緩沖液中于25℃保溫,測定1和24h的殘余酶活力.結(jié)果表明,該酶在不同pH的緩沖液中保溫1h后,酶活力基本未發(fā)生變化.保溫24h的結(jié)果如圖2所示.從圖2可以看出超嗜熱酯酶APE1547在酸性條件下不穩(wěn)定,pH值為6.0范圍時(shí),酶活力損失了33.3%;當(dāng)pH值在6.5～9.0范圍時(shí),酶是穩(wěn)定的,殘余酶活力大于93%;當(dāng)pH值在9.0～10.0范圍時(shí),酶也基本上是穩(wěn)定的.由此可見,該酶在堿性偏中性(pH=6.5～10)范圍內(nèi)時(shí),其穩(wěn)定性較高,殘余酶活力在90%以上.在低pH值下,酶表面凈電荷發(fā)生變化,蛋白分子之間原先的相互排斥作用減弱,而疏水相互作用加強(qiáng),使蛋白質(zhì)分子大量聚集沉淀是導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降的主要原因.但是當(dāng)把溶液的pH調(diào)回該酶的適合pH范圍內(nèi)時(shí)沉淀全部消失,說明pH的變化只是改變了酶表面的電荷分布,使其沉淀,但該變性過程是可逆的.這也說明了該酶具有高度的pH穩(wěn)定性,且pH的穩(wěn)定范圍較寬.2.3超嗜熱酯酶ape1549對有機(jī)溶劑的影響有機(jī)溶劑對酶活力的影響見表2.從表2可以看出,強(qiáng)極性溶劑二甲亞砜和甲醇對酶活力的影響較大,當(dāng)有機(jī)溶劑的lgP大于-0.3時(shí),除吡啶外,酶都保持了很高的活力.通常酶在lgP為1時(shí)已經(jīng)基本沒有活力了,而超嗜熱酯酶APE1547在除了上述所提的3個(gè)有機(jī)溶劑外,剩余活力都在60%以上,顯示超嗜熱酯酶