血根堿對體外培養(yǎng)的人類宮頸癌hela和siha細胞的影響

血根堿對體外培養(yǎng)的人類宮頸癌hela和siha細胞的影響

宮頸發(fā)病率在中國女性生殖器官腫瘤中最高。因此，選擇抗宮頸藥物具有重要的開發(fā)價值。在中藥中篩選有效且毒副作用小的抗腫瘤藥物已成為中草藥研究領域的熱點之一。血根堿(sanguinarine,SAN)的化學名稱為3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,分子量為367.8,它來源于罌粟科植物博落回的果實。早期的研究發(fā)現(xiàn),它具有抗炎、抗菌、抗氧化作用,并對中樞神經(jīng)有麻醉作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn),它還具有非常好的抗腫瘤功效,目前國內(nèi)還未見任何SAN抗腫瘤研究的報道,即使在國外也主要集中在體外抗乳腺癌、前列腺癌等少數(shù)幾種腫瘤的研究。2002年Ding等曾研究過SAN對抗藥性宮頸癌細胞的影響。我們利用兩種不同的人類宮頸癌細胞株研究了血根堿的抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移作用。現(xiàn)報道如下。1材料和方法1.1細胞、培養(yǎng)基和血清本實驗中我們選擇了HeLa細胞作為宮頸腺癌的代表,Siha細胞作為宮頸鱗癌的代表。這兩株細胞均購于美國ATCC公司。SAN(>99.0%)、胰酶、活細胞代謝物還原劑噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DM-SO)購于美國Sigma公司,D-MEM培養(yǎng)基和血清購于Gibcol公司。SAN由DMSO溶解制備成2mmol/L的儲備液,-20℃下保存?zhèn)溆谩?.2酶活劑即充填液取對數(shù)生長期的HeLa細胞和Siha細胞接種并培養(yǎng)于37℃、含5%CO2飽和濕度條件下24h。直接采用培養(yǎng)液稀釋SAN到實驗所需濃度。對照組則僅加DMSO,其濃度與最高SAN藥物濃度組一致,但所有實驗中DMSO含量均低于1/104。1.3mtt法確定了抗癲癇對細胞生長的影響1.3.1mtt法培養(yǎng)適合不同的細胞系統(tǒng)影響用0.25%的胰酶消化對數(shù)生長期的細胞,制備單細胞懸液,將5×104個/ml的HeLa細胞和Siha細胞分別接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種200μl。在37℃、含5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)24h后,加入濃度分別為0、0.1、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5和5.0μmol/L的SAN,每一濃度設6個復孔。然后在細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后,加入20μl濃度為5mg/ml的MTT,再培養(yǎng)4h后輕輕吸掉培養(yǎng)基。加入100μlDMSO振蕩溶解10min。在酶標儀上選取570nm主波長和630nm參考波長測定吸光度值,對照組細胞存活率設為100%,其余各組細胞存活率=(各濃度組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。1.3.2細胞存活率測定細胞同上法培養(yǎng)24h后,加入1.5μmol/L的SAN后分別于12、24、36、48和60h時測定細胞存活率。其他實驗步驟同1.3.1中所述。1.4細胞毒性檢測對數(shù)生長期細胞制備單細胞懸液,調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml,將HeLa細胞和Siha細胞分別接種于直徑為60mm的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24h后加入0、0.1、0.5、1.0、2.0和3.0μmol/L的SAN,每一濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后用胰酶消化制備單細胞懸液,以500個細胞/皿接種至60mm的培養(yǎng)皿,每個計量點設3個平行樣,培養(yǎng)14d后經(jīng)PBS漂洗、甲醇固定、Gimsa染色。在顯微鏡下計數(shù),含50個細胞以上的細胞集落作為一個克隆計數(shù)。1.5細痕的制備和生長抑制率的測定采用體外劃痕方法測定細胞浸潤能力。取對數(shù)生長期細胞,按1×106個/ml接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)至細胞完全飽和。用無菌的200μl的槍頭垂直劃出一無細胞的細痕,制作培養(yǎng)細胞傷口模型。接著用PBS小心清洗3次,去除漂浮細胞(此時作為劃痕后零時),每孔加2ml培養(yǎng)基和0.5μmol/LSAN(此濃度對HeLa細胞和Siha細胞的生長抑制作用均<10%)。同時設陰性對照組,每組設3個平行樣。對照組和0.5μmol/L劑量組分別培養(yǎng)24h和48h后顯微鏡下觀察劃痕寬度,數(shù)碼照相機拍照,測量劃痕寬度。1.6b指示系統(tǒng)s所有實驗均重復3次以上,結果均以x±s表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用方差分析,P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。2結果2.1兩組患者治療前后hela細胞存活率的比較MTT比色法顯示HeLa細胞和Siha細胞經(jīng)SAN處理24h后,細胞生長出現(xiàn)明顯抑制,并呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1)。例如,與未處理對照細胞相比(設為100%),0.5μmol/LSAN處理后,HeLa細胞的存活率為85.3%(P<0.05,95%CI為77.9%~92.8%);當SAN濃度增加為1μmol/L時,HeLa細胞的存活率降低到57.5%(P<0.01,95%CI為52.2%~62.8%);5μmol/LSAN處理后,HeLa細胞的存活率僅約為3%(P<0.01;95%CI為1.2%~5.7%)(IC50為4.86μmol/L)。而在1μmol/L和5μmol/LSAN處理后,Siha細胞的存活率分別約為72%和10%(P<0.01;95%CI分別為70.0%~75.9%和5.6%~11.5%)(IC50為5.95μmol/L)。顯然,Hela細胞對SAN處理的敏感性比Siha細胞高。當我們將1.5μmol/LSAN加至細胞培養(yǎng)中,然后在處理后12、24、36、48和60h檢測細胞存活率。結果發(fā)現(xiàn),隨著處理時間的延長,HeLa和Siha兩種細胞的存活率都逐漸減小(圖2),即呈明顯的處理時間依賴關系。和圖1結果一致,HeLa細胞較Siha細胞對SAN處理更為敏感。2.2兩組細胞內(nèi)克隆數(shù)的比較取500個細胞/皿接種培養(yǎng)14d后,對照組HeLa細胞和Siha細胞的克隆數(shù)分別達到33和33.3個,即大約15%的細胞克隆形成率。隨著SAN濃度的增大,HeLa細胞和Siha細胞的克隆數(shù)則逐漸減少,呈明顯的劑量依賴關系(圖3)。如1.0μmol/LSAN處理24h后,HeLa細胞和Siha細胞的克隆形成數(shù)分別為14和16個,而當SAN濃度增加到3μmol/L時,HeLa細胞和Siha細胞的克隆形成數(shù)分別為2和3個,和對照組相比,SAN處理組的克隆形成數(shù)隨著濃度的增加逐漸減低(P<0.05)。2.3兩組“細胞口腔”寬度對比0.5μmol/LSAN處理HeLa細胞和Siha細胞48h后,對照組“細胞傷口”寬度分別為(0.51±0.04)mm和(0.64±0.02)mm,處理組“細胞傷口”寬度為(1.22±0.02)mm和(1.63±0.01)mm。兩組分別相比,P<0.01和P<0.05。結果提示,SAN處理后顯著抑制了HeLa細胞和Siha細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力,即覆蓋“細胞傷口”的能力,并呈時間依賴關系。體外劃痕試驗鏡下觀察結果見圖4。3化合物的體外生長作用宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤,中、晚期腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。因此,能更好地抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移的新藥成為當今腫瘤研究領域的一個熱門研究方向。SAN是從傳統(tǒng)中藥罌粟科博落回中提取的一種生物堿,具有多種藥理作用及用途。有研究發(fā)現(xiàn),它具有廣譜的抗菌作用,具有改善肝功能及增強免疫力的功能,對T淋巴細胞和B淋巴細胞都有刺激作用。近年來的研究表明,SAN在體外實驗中對多種類型的腫瘤細胞如乳腺癌MCF-7細胞,前列腺癌LNCaP、DU-145和PC-3細胞、白血病K562細胞、胰腺癌AsPC和BxPC-3細胞和皮膚癌A431等有非常好的抑制生長的作用。我們將SAN直接加入HeLa細胞和Siha細胞培養(yǎng)液中24h后,MTT實驗和克隆形成實驗證實,SAN對HeLa細胞和Siha細胞的生長都有顯著的抑制作用,并呈劑量依賴性,隨著SAN濃度的增加,其細胞生存率隨之逐漸下降,并且HeLa細胞較Siha細胞更為敏感。已有實驗室研究表明,SAN的抗腫瘤細胞生長作用與細胞周期阻