高脂飲食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纖維化動(dòng)物模型的建立

高脂飲食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纖維化動(dòng)物模型的建立

肝炎是指肝臟疾病，與肝炎和肝炎相似，但沒(méi)有飲酒過(guò)量的病史。從病理上看，它是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的脂肪變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪積聚等臨床癥狀。NASH可進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝纖維化、肝硬化和原發(fā)性肝癌。目前高脂飲食所致NASH的動(dòng)物模型多有報(bào)道,而NASH肝纖維化模型目前尚少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的高脂飲食方法建立大鼠NASH肝纖維化模型,并對(duì)模型進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià),為臨床研究NASH肝纖維化的發(fā)生機(jī)制及非侵入性、特異性肝纖維化指標(biāo)的研究提供理想的動(dòng)物模型,以便為NASH肝纖維化的防治提供理想的研究平臺(tái)。1材料和方法1.1動(dòng)物和食物的制備1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)分工和方法1.2.2動(dòng)物死亡1.3觀察指標(biāo)和方法1.3.1一般情況、體重和肝指數(shù)1.3.2肝功能與血清脂質(zhì)改變1.3.3肝組織病理學(xué)的檢測(cè)1.3.4肝組織mason染色和mason染色半定量纖維1.4統(tǒng)計(jì)處理2結(jié)果2.1一般情況下2.2體重和肝指數(shù)的變化2.3肝功能與血清脂質(zhì)改變2.4肝組織的肝染色2.5肝組織mason染色和mason染色半定量纖維3模擬大鼠肝纖維化模型的建立近年來(lái),我國(guó)患有肥胖、高脂血癥、高血壓、糖尿病及藥物性肝損害的人數(shù)逐年增加,由此引起的非酒精性肝病(NAFLD)的發(fā)病率也成上升趨勢(shì)。Miele等認(rèn)為,脂肪性肝病是一種良性的病變,但發(fā)展為NASH時(shí),因其具備彌漫性脂肪浸潤(rùn)、小葉內(nèi)炎癥壞死、肝細(xì)胞氣球樣變、肝纖維化等典型病變過(guò)程,NASH不再認(rèn)為是一種良性病變,它可作為其他嚴(yán)重肝病的前驅(qū)病變。尤其是NASH中發(fā)生的纖維化,因其可導(dǎo)致不可逆性的肝硬化,甚至原發(fā)性肝癌,目前成為研究的焦點(diǎn)。然而NASH中發(fā)生纖維化的機(jī)制至今尚未闡明,因此制備出一種制作方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、價(jià)格低廉、動(dòng)物死亡率低、復(fù)制率高、病變接近于人類(lèi)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的動(dòng)物模型成為研究關(guān)鍵。近年來(lái)NAFLD動(dòng)物模型的研究有了很大的進(jìn)展,其中單純性脂肪肝動(dòng)物模型已比較成熟,而進(jìn)展期NASH動(dòng)物模型尚在探索階段。在眾多的造模方法中,高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD的模型,在病因、病理及發(fā)病背景方面同人類(lèi)NAFLD相類(lèi)似。范建高等應(yīng)用基礎(chǔ)飼料+100g/kg豬油+20g/kg膽固醇喂養(yǎng)雄性SD大鼠,到12周時(shí)出現(xiàn)高膽固醇血癥,中重度脂肪肝伴有小葉內(nèi)炎癥,從而成功的建立了高脂飲食誘發(fā)的NASH模型。徐正婕等繼續(xù)用此配方造模,16周時(shí)少數(shù)造模大鼠出現(xiàn)輕度的竇周纖維化,24周所有大鼠都出現(xiàn)竇周纖維化,1例出現(xiàn)橋接纖維化。從而通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)24周成功建立起大鼠體質(zhì)量超重、高脂血癥、脂肪性肝炎伴肝纖維化模型。但其不足之處是,造模時(shí)間長(zhǎng),造模24周出現(xiàn)NASH伴有肝纖維化;對(duì)于各個(gè)時(shí)期的纖維化評(píng)估,只用病理切片進(jìn)行觀察,主觀性較大;雖與人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程相接近,但因以上缺點(diǎn),部分限制了其應(yīng)用。為縮短造模時(shí)間,對(duì)纖維化的評(píng)估更加客觀,建立實(shí)用、穩(wěn)定的NASH肝纖維化模型,現(xiàn)將范建高等的配方進(jìn)行改良,在原有配方的基礎(chǔ)上加用蛋黃粉及膽酸鈉,即82.5%普通飼料+2%膽固醇+10%豬油+5%蛋黃粉+0.5%膽酸鈉,加入蛋黃粉可保證營(yíng)養(yǎng)均衡。大鼠缺少膽囊,在飼料中加入膽酸鈉可以促進(jìn)飼料膽固醇的吸收。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示高脂飲食4周后,大鼠肝臟組織HE染色可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)完整,少許細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性,匯管區(qū)見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),部分肝細(xì)胞壞死。8周后,病變較前加重,達(dá)中至重度脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn),并可見(jiàn)匯管區(qū)纖維組織增生伴有纖維條索形成,開(kāi)始出現(xiàn)肝纖維化趨勢(shì)。造模12周后,大鼠肝組織脂肪變程度達(dá)重度,且纖維化面積增大。肝小葉結(jié)構(gòu)消失,竇周隙纖維增生明顯,幾乎充滿(mǎn)竇周隙,增生的纖維形成粗條索狀包繞匯管區(qū)并向肝小葉間及肝內(nèi),肝小葉中心延伸。Masson染色纖維化半定量顯示造模8、12周后肝組織纖維化面積與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;造模8周后肝組織纖維化面積與造模4周相比,造模12周與造模8周膠原面積比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證明在造模8周時(shí),已出現(xiàn)肝纖維化趨勢(shì),12周時(shí),肝纖維化已經(jīng)形成。檢測(cè)血清脂質(zhì)顯示出現(xiàn)高脂血癥,到8周時(shí)模型組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而到12周時(shí),甘油三酯水平仍在增加。分析原因可能是:進(jìn)入肝內(nèi)的脂肪酸過(guò)多,甘油三酯的合成超過(guò)其轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟的能力;肝內(nèi)脂肪酸β氧化障礙,脂肪酸利用減少,TG合成增加;肝臟合成TG能力增強(qiáng)及脂蛋白代謝酶的活性下降。上述因素造成過(guò)多的脂肪酸在肝細(xì)胞內(nèi)沉積,從而造成肝細(xì)胞脂肪變性。另外,脂肪酸本身具有直接毒性的作用,可引起線(xiàn)粒體的腫脹和通透性的增加,并通過(guò)促進(jìn)CYP2E1和CYP4A表達(dá)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化。Deepa等使用低分子量肝素對(duì)高膽固醇血癥動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)研究,發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥能夠刺激動(dòng)物血液循環(huán)中產(chǎn)生較多的炎癥因子如TNFα及脂質(zhì)介導(dǎo)體如血小板激活因子。TNFα是腫瘤壞死因子家族中的重要一員,在多種細(xì)胞活動(dòng)中起重要作用,在NASH肝纖維化發(fā)生中的作用機(jī)制可以概括為:(1)直接作用于胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),減少酪氨酸磷酸化;減少葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GluT4的表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn),從而減弱胰島素的作用;與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)相拮抗,負(fù)性調(diào)節(jié)與胰島素敏感性有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及脂解作用,介導(dǎo)游離脂肪酸水平升高。(2)還可作為炎性細(xì)胞因子損傷肝細(xì)胞線(xiàn)粒體呼吸功能,使脂肪酸β氧化受抑制,線(xiàn)粒體功能失常,體內(nèi)氧自由基增加,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化,從而引起炎癥和纖維化。脂肪酸還可通過(guò)枯否氏細(xì)胞而影響肝星狀細(xì)胞(HSC),共同參與脂肪肝肝纖維化的發(fā)生。HSC激活后,具有成纖維細(xì)胞的功能,分泌膠原、纖維蛋白及各種細(xì)胞因子包括維持炎癥和炎癥因子的補(bǔ)充。因此NASH及肝纖維在發(fā)病機(jī)制上表現(xiàn)為相互影響相互促進(jìn)。用此種方法制備的NASH肝纖維化模型,與人類(lèi)的自然疾病發(fā)病過(guò)程相接近,且用時(shí)短、死亡率低、材料容易獲得及轉(zhuǎn)運(yùn)、成本低,是研究NASH肝纖維化發(fā)病機(jī)制和尋求臨床防治策略的一個(gè)很好的研究工具。選用SPF級(jí)健康雄性SD大鼠,體重120~160g,由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于山東省立醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,溫度(20±2)℃,濕度40%,明暗各12h,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食水。高脂飼料(82.5%普通飼料、2%膽固醇、10%豬油、5%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所生產(chǎn)提供,飼料經(jīng)機(jī)器壓制成條狀,密封、真空25℃以下保存。普通飼料由山東省立醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=30)給予普通飼料,自由飲水;模型組(n=30)給予高脂飼料,自由飲水。分別于第4、8、12周末處死正常對(duì)照組及模型組大鼠各10只。動(dòng)物隔夜禁食,次日稱(chēng)量體重后,以3%戊巴比妥鈉按0.1ml/100g腹腔注射麻醉動(dòng)物,下腔靜脈采血后,迅速取出肝臟稱(chēng)量。留取楔形肝臟組織標(biāo)本,面積為1.5cm×1.5cm,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片,HE染色觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變;Masson染色觀察肝臟纖維化染色,軟件進(jìn)行纖維化半定量分析。觀察大鼠生活狀態(tài)、食欲行為、毛發(fā)、動(dòng)物死亡情況。處死前稱(chēng)量體重,麻醉后取出肝臟,稱(chēng)量肝臟的濕重,計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100%)。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、門(mén)冬氨酸(AST)、總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)等,由全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。將取下的肝組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定后,常規(guī)脫水,包埋,制作成5μm厚切片,HE染色,光鏡下觀察。HE染色由山東省立醫(yī)院病理科專(zhuān)家盲法閱片,分別在低倍鏡(×10)、高倍鏡(×40)下觀察肝組織的病理學(xué)改變。肝細(xì)胞脂肪變性的程度判斷標(biāo)準(zhǔn)參照范建高及Elizabeth等提出的大鼠高脂模型肝細(xì)胞脂肪變的統(tǒng)計(jì)方法。炎癥活動(dòng)度計(jì)分參照王泰齡等提出的慢性肝炎炎癥活動(dòng)度計(jì)分方案。由山東省立醫(yī)院病理科完成。在光學(xué)顯微鏡下,將采集圖像輸入LeicaQwinV3圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行單位(視場(chǎng))面積纖維組織面積測(cè)量。每張切片(每例動(dòng)物標(biāo)本)隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域(視場(chǎng)),用HSV顏色分割法測(cè)量單位面積內(nèi)纖維組織的面積,即每例切片共有5個(gè)數(shù)據(jù),計(jì)算4、8、12周時(shí)對(duì)照組與模型組大鼠肝內(nèi)纖維組織面積的均值。計(jì)量資料采用表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠未發(fā)生死亡。正常對(duì)照組生活狀態(tài)良好;模型組大鼠毛發(fā)粗糙,精神萎靡,嗜睡,動(dòng)作遲緩,毛發(fā)漸黃。正常對(duì)照組大鼠肝臟表面光滑,質(zhì)軟,無(wú)結(jié)節(jié)囊腫,色澤粉紅,未見(jiàn)淤血及脂肪變性,無(wú)明顯腫大與萎縮;模型組大鼠肝臟表面光澤差,肝臟體積增大,顏色白膩,切面有油膩感,偶見(jiàn)淤血及米粒大小的結(jié)節(jié)(圖1)。在造模過(guò)程中,兩組的體重均在增加。4周時(shí),正常組與模型組體重及肝指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8周至造模結(jié)束時(shí),模型組體重增加快于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而肝指數(shù)也較模型組高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繼續(xù)造模至12周,體重雖都有增長(zhǎng),但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但模型組中肝臟脂質(zhì)的沉積較前加重,且與此時(shí)正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。造模4周時(shí)模型組血清ALT、AST、TG、TCHO水平雖較對(duì)照組有所升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8周及12周末模型組ALT、AST較正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8至12周造模過(guò)程中,模型組TG逐漸增高,與正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模12周時(shí)TCHO水平雖較8周時(shí)略有回落,但與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心,呈放射狀排列,無(wú)肝細(xì)胞變性壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2a)。模型組4周時(shí)即有輕微的脂肪變性,但肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)之比值為<1/3,肝小葉結(jié)構(gòu)完整,病變的肝細(xì)胞散在于肝小葉內(nèi),可見(jiàn)有嗜酸性小體,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯(圖2b);8周時(shí),大鼠肝組織光鏡下見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,脂肪變的肝細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的1/3~2/3,且出現(xiàn)碎屑樣壞死,匯管區(qū)有單核細(xì)胞浸潤(rùn),竇周隙增寬,炎癥活動(dòng)度計(jì)分明顯高于對(duì)照組(圖2c)。4~8周病變逐漸加重,至12周時(shí),中至重度肝細(xì)胞脂肪變性,肝細(xì)胞腫大,胞漿內(nèi)脂滴以大泡性脂肪變?yōu)橹?胞核被擠至一側(cè),以肝小葉周邊脂肪變性最為嚴(yán)重(圖2d),且可見(jiàn)小葉炎癥,炎癥細(xì)胞以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)為主,可見(jiàn)以中央靜脈為中心的壞死條帶延伸(圖2e)。正常大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,匯管區(qū)內(nèi)有綠色膠原纖維染色外,未見(jiàn)有染成綠色的膠原纖維,竇周隙見(jiàn)少量增生的膠原纖維(圖3a)。4周時(shí)肝小葉結(jié)構(gòu)尚存,纖維局限于匯管區(qū),細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,竇周隙內(nèi)少量膠原纖維增生(圖3b)。至8周,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,小葉中央有膠原