一種新的廢用性骨質(zhì)疏松山羊模型的建立

一種新的廢用性骨質(zhì)疏松山羊模型的建立

剩余骨松弛是由于機(jī)械應(yīng)力減少或局部或全身骨量流失，以及骨質(zhì)量下降。廢用性骨質(zhì)疏松患者除出現(xiàn)骨痛、功能障礙、無外傷或微外傷性骨折外,還可并發(fā)軟組織鈣化、泌尿系結(jié)石等,導(dǎo)致骨折不愈合或延遲愈合或再骨折,形成骨折固定、骨量減少、骨質(zhì)疏松再骨折、再固定的惡性循環(huán),延誤治療時機(jī),給患者增加痛苦和治療費(fèi)用,不僅造成社會醫(yī)療資源的浪費(fèi),而且明顯降低了康復(fù)質(zhì)量,延長了康復(fù)過程。在骨病、骨折、關(guān)節(jié)損傷等發(fā)生于中青年或兒童時繼發(fā)此病還可加重社會生產(chǎn)力損害,可使病兒殘疾,影響兒童健康成長。因此,預(yù)防或治療廢用性骨質(zhì)疏松具有非常重要的臨床和社會實用價值。本研究通過叩擊式骨應(yīng)力刺激儀對廢用性骨質(zhì)疏松的實驗造模山羊相關(guān)檢測指標(biāo)的影響,發(fā)現(xiàn)該儀器對預(yù)防廢用性骨質(zhì)疏松具有較好的效果。1材料和方法1.1小錘輸出的設(shè)計叩擊式骨應(yīng)力刺激儀(發(fā)明專利號:CN803117),包括儀器殼、聯(lián)接在儀器殼一側(cè)的水平槽式托架和裝在儀器殼內(nèi)的電機(jī)、小錘以及用于驅(qū)動電機(jī)的控制電路(圖1);電機(jī)以軸線前后向固定在儀器殼內(nèi)的上部,電機(jī)轉(zhuǎn)軸上固接有一連接輪;小錘包括沿左右向設(shè)置的錘頭和豎向設(shè)置的錘桿,錘桿的一端與錘頭相固接,另一端固接在殼內(nèi)的頂端;在錘桿的中部設(shè)有滑孔,滑孔內(nèi)套有可沿滑孔上下移動的滑塊,滑塊固定在連接輪的偏心位置處;錘頭的前端設(shè)為圓弧狀,沿著錘頭運(yùn)動前方的儀器殼上設(shè)有錘孔,錘孔通入托架的水平槽。外形設(shè)計采用醫(yī)療不銹鋼材料制成,通過控制面板可控制小錘輸出應(yīng)力的大小和頻率,應(yīng)力的大小可控制在20～350N之間,應(yīng)力的頻率可控制在0.1～40Hz之間。托架為水平槽式,長335mm,寬105mm,高117.5mm,小錘應(yīng)力輸出方向與托架平行。1.2單次飼養(yǎng)時只暴露2個月內(nèi)坐骨神經(jīng),t4月齡山羊18只(中國人民解放軍第175醫(yī)院動物實驗室提供,體重14～15kg),隨機(jī)分為3組:①對照組(control,C):只暴露右側(cè)坐骨神經(jīng),但不切斷;②廢用組(unloading,U):切斷右側(cè)坐骨神經(jīng);③治療組(treatment,T):切斷右側(cè)坐骨神經(jīng)。術(shù)后山羊被按組分開飼養(yǎng),可以自由飲水,圈內(nèi)四角放置飼料,任實驗動物自由進(jìn)食。室溫保持在25±2℃,12h間隔照明,定期消毒和通風(fēng)。1.3跨股精神經(jīng)分離以2%戊巴比妥鈉(30mg/kg體重)腹腔內(nèi)注射麻醉,無菌條件下,在股骨大轉(zhuǎn)子后側(cè)5mm處作一縱行切口,長約2cm,依次切開皮膚、皮下組織、筋膜,在股二頭肌和股四頭肌之間進(jìn)行鈍性剝離,暴露出坐骨神經(jīng)。用1%利多卡因進(jìn)行局部麻醉后,切除2cm的坐骨神經(jīng)。1.4單次給藥時專單次進(jìn)行正確的夯實實驗組以石膏固定治療組山羊先行坐骨神經(jīng)切斷術(shù),待切口完全愈合后,為了便于叩擊式骨應(yīng)力刺激儀的操作,給予山羊右下肢伸直位管型石膏固定,石膏固定時按規(guī)范操作,避免實驗動物肢體壓瘡(圖2)。設(shè)定恒定的叩擊應(yīng)力100N,叩擊頻率3Hz。具體治療方法為:每天治療3次,每次60min,每次間隔3h,總共治療4個月。1.5小鼠小鼠股骨保鮮各組山羊分別于術(shù)后2個月和4個月處死,完整取出右側(cè)脛骨,剝離附著的軟組織。用浸透生理鹽水的紗布將各組標(biāo)本包好后分別放入標(biāo)本袋中,做好標(biāo)記,置于-20℃保存。1.6測試指標(biāo)1.6.1骨密度測定方法骨密度(BMD)在美國NORLAND公司生產(chǎn)的XR-46型快速雙能X線骨密度測量儀上使用小動物軟件進(jìn)行測定。骨密度(BMD,g/cm2)是通過電腦用骨礦含量除以外表面積計算出來。掃描模式:慢速。1.6.2材料點彎曲實驗用薄塑料紙將脛骨標(biāo)本包裹,防止試驗過程中樣本干燥。樣本兩端用自凝樹脂固定,注意固定時統(tǒng)一包埋深度。放置固定好的樣本于實驗臺,進(jìn)行三點彎曲實驗。在BiominMTS858萬能材料實驗機(jī)上,在一個5mm/min恒定的變形率作用下施加載荷,一個壓桿在脛骨的上方中點。通過試驗機(jī)的力傳感器和位移傳感器,試驗機(jī)就能將脛骨中心點的力與位移曲線在計算機(jī)上顯示出來,并隨后用電腦分析。1.6.3鞋案樣品的制備脛骨標(biāo)本先以10%福爾馬林固定24h,再以10%甲酸-福爾馬林同步固定與脫鈣2w,每3d更換脫鈣液,脫鈣滿意后切取脛骨近側(cè)干骺端及脛骨干中段0.5cm大的標(biāo)本,蒸餾水徹底沖洗后,將標(biāo)本置于70、80、90、95、100﹪乙醇中逐級脫水,氯仿透明,石蠟包埋,分別做橫向及縱向切片,厚度為6μm,HE染色及Masson三色染色,光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。1.7統(tǒng)計學(xué)分析所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,各組間比較用one-wayANOVA方差分析,P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示有非常顯著性差異。2結(jié)果2.1兩組患者治療前、后肢體壓安全實驗中無動物意外死亡,廢用組1只山羊術(shù)后出現(xiàn)營養(yǎng)不良性潰瘍,治療組1只山羊出現(xiàn)肢體壓瘡。廢用組山羊在切斷坐骨神經(jīng)后就出現(xiàn)患肢跛行,至術(shù)后4個月仍然不能恢復(fù)。該兩組實驗山羊在造模后能夠以三個下肢行走及正常覓食。2.2兩組患者廢用性骨髓從-bmd的比較與對照組比較,廢用組山羊2個月后脛骨的BMD值顯著降低(P<0.01),并且持續(xù)至術(shù)后4個月,說明廢用性骨質(zhì)疏松模型復(fù)制成功。治療組與對照組比較,BMD值也存在差別(P<0.05);而與廢用組比較,治療組的脛骨BMD值均增高,且差異非常顯著(P<0.01)(見表1)。2.3兩組載荷及材料力學(xué)指標(biāo)比較各組山羊右側(cè)脛骨三點彎曲實驗的力學(xué)測試結(jié)果見表2。廢用組與對照組比較,骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)最大載荷及材料力學(xué)指標(biāo)彈性模量顯著下降,差別均有極顯著性意義(P<0.01)。治療組的脛骨的力學(xué)參數(shù)與對照組之間比較,無論在實驗后2個月還是4個月,各參數(shù)差別也具顯著性(P<0.05);而與廢用組相比,則存在非常顯著的差異(P<0.01)。治療組力學(xué)性能明顯好于廢用組的力學(xué)性能。2.4治療組與對照組骨小梁染色見廢用3組的脛骨組織切片在光學(xué)顯微鏡下觀察可見明顯差別:HE染色見廢用組骨小梁較對照組和治療組明顯減少、變細(xì)(見圖3);Masson染色見廢用組骨基質(zhì)礦化不良,骨基質(zhì)中礦物成分較對照組和治療組明顯減少(見圖4)。3討論3.1廢用組的材料改變的研究首先,從本實驗結(jié)果看,該模型產(chǎn)生的局部廢用性骨質(zhì)疏松非常明顯。廢用組脛骨骨皮質(zhì)較對照組明顯變薄,骨小梁變細(xì)、減少。與對照組比較,廢用組脛骨的骨礦含量(BMC)及骨密度(BMD)均出現(xiàn)了非常明顯的減少或降低(P<0.01)。廢用肢體骨的BMC和BMD的顯著下降,是廢用性骨質(zhì)疏松造模成功的標(biāo)志。從骨組織形態(tài)學(xué)測量結(jié)果看:廢用組松質(zhì)骨骨體積、骨小梁較對照組明顯減少、變細(xì),而骨小梁間隔則顯著高于對照組;骨小梁表面破骨細(xì)胞增生活躍,而成骨細(xì)胞較少,這說明廢用組肢體的松質(zhì)骨骨量和微結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化。與對照組相比,廢用組脛骨的生物力學(xué)性能也發(fā)生了明顯的變化。廢用組脛骨比對照組脛骨的最大載荷和彈性模量均有非常顯著的下降,一方面源于其膠元纖維排列紊亂、斷裂,另一方面源于骨礦物質(zhì)沉積減少,骨小梁稀疏,皮質(zhì)骨單位減少,骨密度較低。最大載荷是骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù),代表的是在載荷-變形曲線的最高點處骨標(biāo)本所承受的外力;彈性模量是材料力學(xué)參數(shù),指彈性限度內(nèi)應(yīng)力與對應(yīng)應(yīng)變的比值,即載荷-變形曲線在彈性區(qū)的斜率,用來測量骨組織的內(nèi)硬度。這一指標(biāo)主要反映了骨組織的材料特性,與材料的量的大小無關(guān)。以上指標(biāo)的下降,說明了坐骨神經(jīng)切斷的方法成功地建立了符合生物力學(xué)改變要求的廢用性骨質(zhì)疏松山羊模型。而以上的多種測量指標(biāo)的變化也充分證明了坐骨神經(jīng)切斷山羊模型達(dá)到了廢用性骨質(zhì)疏松的標(biāo)準(zhǔn)。實驗結(jié)果進(jìn)一步證明:如果在坐骨神經(jīng)切斷后及時預(yù)防性使用叩擊式骨應(yīng)力刺激儀,脛骨的BMD就會明顯升高;治療組的肢體脛骨松質(zhì)骨骨小梁較廢用組增多、變粗,骨小梁表面成骨細(xì)胞增生活躍,而破骨細(xì)胞很少;評價骨的力學(xué)性能的各項指標(biāo)均出現(xiàn)明顯的升高。以上結(jié)果充分說明叩擊式骨應(yīng)力刺激儀可以有效預(yù)防山羊坐骨神經(jīng)切斷后脛骨出現(xiàn)的骨量和骨質(zhì)量的降低。多個指標(biāo)的綜合研究結(jié)果表明,叩擊式骨應(yīng)力刺激儀不僅可以通過抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成來增加骨量,而且可以通過改善骨骼的微結(jié)構(gòu)來提高骨的質(zhì)量,改善骨的生物力學(xué)性能,從而預(yù)防山羊坐骨神經(jīng)切斷誘導(dǎo)的廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。3.2骨組織的力學(xué)刺激機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)骨的形成,同時影響骨的大小、形狀和強(qiáng)度。應(yīng)力的大小和頻率跟骨組織的正常代謝密切相關(guān)。長期以來已經(jīng)認(rèn)識到力學(xué)因素在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過程中也具有重要的作用;增加骨骼的力學(xué)負(fù)荷可導(dǎo)致骨量的增加,而減少骨骼的負(fù)荷則導(dǎo)致骨量丟失。Alexander等通過四點彎曲梁實驗裝置,對大鼠失重脛骨施加不同強(qiáng)度的應(yīng)力刺激,結(jié)果表明在一定的應(yīng)力范圍內(nèi),骨形成和應(yīng)力大小成正比關(guān)系,隨著應(yīng)力的增加,骨形成加速;當(dāng)應(yīng)力作用超過一定的范圍,就會抑制骨形成。Frost’s靜力學(xué)理論提出,當(dāng)骨組織所受力學(xué)刺激<200μstrain,骨吸收明顯大于骨形成,導(dǎo)致骨的凈丟失,如廢用性骨量丟失;當(dāng)骨組織所受力學(xué)刺激在200～2500μstrain范圍之內(nèi),骨組織處于一個正常的生理學(xué)力學(xué)環(huán)境之中,骨形成與骨吸收維持動態(tài)平衡,沒有骨組織的凈形成和凈丟失,保證了骨組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定;當(dāng)骨組織所受力學(xué)刺激在2500～5000μstrain范圍之內(nèi),骨形成明顯大于骨吸收,在骨表面形成片層骨,增加骨的建造;當(dāng)骨組織所受力學(xué)刺激>5000μstrain,在骨表面出現(xiàn)病理性編織骨,與骨損傷修復(fù)、骨折愈合的情況相一致。骨作為有生命的材料,對其進(jìn)行振動刺激,其生理承受的頻率范圍也應(yīng)該考慮。Turner等報道當(dāng)應(yīng)力頻率小于0.5Hz時,載荷不能誘導(dǎo)骨生成;而當(dāng)動態(tài)加載頻率為2.0Hz時,骨生成的速度可增加4倍。相關(guān)研究顯示,在機(jī)械振動和牽拉刺激中,低頻刺激可提高成骨細(xì)胞的活性,促進(jìn)其增殖和分化,而高頻刺激則抑制成骨細(xì)胞的增殖與活性。但是持續(xù)性應(yīng)力刺激也不利于促進(jìn)成骨細(xì)胞活性,循環(huán)的或周期性應(yīng)力刺激比持續(xù)刺激更能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和基因表達(dá)。Browner通過一項動物實驗發(fā)現(xiàn)30～300Hz的刺激,可引起骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生,而0.5～3Hz之間較低頻率的周期載荷,可以促進(jìn)新骨形成,防止骨質(zhì)疏松,而3Hz類似動物慢跑的頻率。在周期性力學(xué)刺激中,頻率為1Hz的力