校準曲線的繪制

校準曲線的繪制1、標準曲線的制作依據(jù)GB/T22554-2010《基于標準樣品的線性校準》中：1）標準曲線的濃度范圍應覆蓋正常操作條件下的被測量范圍；2）標準樣品的組分盡量與被測樣品組分一致；3）標準樣品的濃度值應等距離的分布在被測量范圍；4）標準樣品的個數(shù)至少應有3個濃度；5）每個標準點至少重復2次，這個重復是指從稀釋開始；如果國家標準有相應的濃度系列推薦，盡量按國家標準。工作中我們經(jīng)常采用線性校準，因為線性方程最為簡潔。2、校準曲線類別校準曲線包括標準曲線和工作曲線，前者用標準溶液系列直接測量，沒有經(jīng)過預處理過程，這對于樣品往往造成較大誤差；而后者所使用的標準溶液經(jīng)過了與樣品相同的消解、凈化、測量等全過程。3、首先標曲要做幾個點標準曲線需要幾個數(shù)據(jù)點，是由所檢測組分的濃度范圍、分析儀響應特性、干擾因素、濃度與檢測信號響應類型有關的。3個點：對于一些低濃度，特別是微量分析，并且濃度范圍不是很大的，檢測器響應可靠，背景干擾非常小的，則可以選用較少的工作點就行，一般有3個濃度點就足夠了，有些甚至可以只用一個濃度點就行，另一個點直接用坐標原點。4~6個點：對于平時測量的樣品濃度范圍較寬，并且檢測器響應不完全是一次曲線（直線）的，可以采用二次曲線或分段校正方式，以減少數(shù)據(jù)偏差，這種情況就需要多用幾個數(shù)據(jù)點，如果不分段，數(shù)據(jù)點有4~6個就夠用。至少兩個點：但如果是分段校正，則每段需要至少兩個數(shù)據(jù)點。而對于一些樣品無濃度范圍規(guī)律的，特別是一些檢測機構，如果分析儀的檢測響應可靠，環(huán)境因素影響少的，可以做校正曲線。若是環(huán)境因素影響大的，則不必做校正曲線，而采用標準加入法或標準加入-一次稀釋法反而簡便一些。實際上，我們一般是做五個點（不包括零濃度）；一般以檢出限的5~10倍為第一個點，以后根據(jù)1倍遞增，最高濃度是最低濃度的10~20倍為宜（理化分析實驗為例）。當然，要根據(jù)儀器的靈敏度來調(diào)整。4、標曲R值是幾個9才合格？實驗室應按檢測標準（方法）的要求使用標準溶液或標準物質(zhì)建立標準曲線。所用標準溶液或標準物質(zhì)應覆蓋被測樣品的濃度范圍。檢測標準（方法）如無具體的要求，至少使用5個標樣（除空白外）建立線性標準曲線，每個點重復測定1-3次，對于篩選方法，線性回歸方程的相關系數(shù)不應低于0.98，對于確證方法，相關系數(shù)不應低于0.99。其實，大于0.99是判斷是否為線性相關的一個標準，實際應用中線性大于0.999才是比較理想的。線性在0.99到0.999之間的監(jiān)測結果只用接近最高濃度一半（中間濃度）的位置才比較準確，如果線性大于0.999的話，在整個線性范圍內(nèi)都會有一個比較滿意的結果。如果檢測的線性不好，可以減少標準的覆蓋范圍，將標準的濃度調(diào)整到待測樣品濃度附近，這樣結果也是非常準確的。例如，樣品的濃度約20ppb，但在0~50ppb范圍建立標準曲線，但線性非常不理想，這時可以將標準范圍調(diào)整到15~25ppb之間，作五個標準。5、標準曲線的檢驗？（1）線性檢驗：即檢驗校準曲線的精密度。對于以4～6個濃度單位所獲得的測量信號值繪制的校準曲線，分光光度法一般要求其相關系數(shù)|r|≥0.9990，否則應找出原因并加以糾正，重新繪制合格的校準曲線。（2）截距檢驗：即檢驗校準曲線的準確度，在線性檢驗合格的基礎上，對其進行線性回歸，得出回歸方程y=a+bx，然后將所得截距a與0作t檢驗，當取95%置信水平，經(jīng)檢驗無顯著性差異時，a可做0處理，方程簡化為y=bx，移項得x=y/b。在線性范圍內(nèi)，可代替查閱校準曲線，直接將樣品測量信號值經(jīng)空白校正后，計算出試樣濃度。當a與0有顯著性差異時，表示校準曲線的回歸方程計算結果準確度不高，應找出原因予以校正后，重新繪制校準曲線并經(jīng)線性檢驗合格。在計算回歸方程，經(jīng)截距檢驗合格后投入使用?；貧w方程如不經(jīng)上述檢驗和處理，就直接投入使用，必將給測定結果引入差值相當于解決a的系統(tǒng)誤差。（3）斜率檢驗：即檢驗分析方法的靈敏度，方法靈敏度是隨實驗條件的變化而改變的。在完全相同的分析條件下，僅由于操作中的隨機誤差導致的斜率變化不應超出一定的允許范圍，此范圍因分析方法的精度不同而異。例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相對差值小于5%，而原子吸收分光光度法則要求其相對差值小于10%等等。6、標準曲線有效期的規(guī)定（1）標準曲線屬于實驗室質(zhì)量控制的范圍，按照《實驗室資質(zhì)認定評審準則》中結果控制的要求：定期使用有證標準物質(zhì)（參考物質(zhì)）進行監(jiān)控和/或使用次級標準物質(zhì)（參考物質(zhì)）開展內(nèi)部質(zhì)量控制。（2）準則中并未對“定期”進行規(guī)定，所以如果“定期”，就根據(jù)實驗室的實際情況來定了。（3）既然準則上沒說明，那根據(jù)一般的分析教材，當實驗條件（包括藥劑、人員、儀器等）發(fā)生變化時，最好重新制作標準曲線。一般來說儀器如果長期使用，并經(jīng)過檢定，是處于穩(wěn)定狀態(tài)，而人員藥劑的變化往往會較大。如果說每次換個人操作都要換曲線，那工作量就太大了。7、每次開機都必須做標準曲線？1、每天所配的流動相都會有所不同，導致出峰的時間都會有一定的差異，峰面積相應都有所差異。2、檢測器光能也在不斷的衰弱，因此其每天的相應值也有所不同，其峰面積也有差異?；谝陨显颍瓌t上應該是每天都要進行標準曲線校正的。標準曲線不要每次都做，但是每次必須進標準品樣品；因為每次你的流動相和原來的不可能完全一樣，同時儀器的狀態(tài)也在變化，所以不同批次間的保留時間是不一致的，所以你必須用隨行標準品來定位與定量。8、校準曲線能不能長期使用每批樣品應測定一個校準曲線中間點濃度的標準液，其測定濃度與校準曲線標準點的濃度相對誤差不得超過規(guī)定范圍，如果超過規(guī)定相對誤差，需重新繪制校準曲線。也可以這樣說，不同的分析項目，不同的分析方法，校準曲線斜率的穩(wěn)定性不同。如校準曲線的斜率較為穩(wěn)定，則在樣品分析時，可只測定兩個標準點，當此兩個標準點與原曲線相應點的相對偏差均小于5%時，可使用原校準曲線。因此，樣品分析前，需根據(jù)斜率的穩(wěn)定性來確定是否需同時制作校準曲線。我們一般的做法是，根據(jù)檢測的頻率來做，如果該項目天天都要檢測，并且檢測量較多時，要求至少每周做一次曲線。如果檢測量上，一個月都沒有幾單的話，就一個月做一次曲線。當然，儀器如果出現(xiàn)故障并大修后回來的，經(jīng)過檢定后，需要重新做曲線。9、標準曲線是否必須過原點標準曲線不一定非要過原點，只要線性好就可以了。因為做空白的話基本上不會過原點。過原點是強制過的，實際曲線可能不過，就會造成誤差。不過原點是因為有系統(tǒng)誤差。針對是否過原點(0，0)問題，可以從原點(0，0)代表的意義來考慮：即所測組分濃度為零的時候，信號響應值（液相色譜也就是峰高或者峰面積）是否也為零。通常來說色譜分析是屬于這種情況的，因而可以把（0，0）點作為一個濃度水平計入標準曲線（甚至不需要真的去配一個濃度為零的標準溶液來進樣），這也是單點法定量的一個依據(jù)；而類似的情況在光譜法測定時就講不通了，濃度為零的標準溶液（本底）響應信號（吸光度）往往不是零，這個時候標準曲線就不一定過原點了。10、標準曲線的線性范圍線性范圍這個大家都比較清楚，主要從相關系數(shù)r看，一般要求r大于等于三個九。之前做實驗有時候濃度高時，線性不好，高濃度點不在標準曲線上，而是在標準曲線的下面，而且離擬合的標準曲線比較遠。遇到這種情況，標準曲線的線性相關系數(shù)就很差，有時候才一個九，最后我終于想明白了，如果自己用手動擬合的話，用平滑的曲線去連接所