發(fā)酵工程第二章發(fā)酵工業(yè)微生物菌種

第二章發(fā)酵工業(yè)微生物菌種

制備原理與技術(shù)第二章第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育第二節(jié)工業(yè)微生物種子的擴(kuò)大培養(yǎng)第三節(jié)種子培養(yǎng)基及其制備第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育工業(yè)微生物的特點(diǎn)發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的分離和選育發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的退化、復(fù)壯與保藏一、工業(yè)微生物的特點(diǎn)我們把用于發(fā)酵工業(yè)的微生物也叫做工業(yè)微生物。工業(yè)微生物具備個(gè)體小、種類多、繁殖快、分布廣、代謝強(qiáng)和易變異等特點(diǎn)。發(fā)酵工程是以微生物的生命活動(dòng)為中心的，各種發(fā)酵生產(chǎn)都必須有相應(yīng)的微生物。所以微生物對(duì)于發(fā)酵過程就十分重要。發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育工業(yè)微生物的特點(diǎn)發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的分離和選育發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的退化、復(fù)壯與保藏二、發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求微生物菌種能否滿足工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際需求，是否有工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值是極為重要的。發(fā)酵工業(yè)對(duì)菌種的要求：能在廉價(jià)原料制備的培養(yǎng)基上迅速的生長(zhǎng)并生成所需的代謝產(chǎn)物，而且產(chǎn)量高；培養(yǎng)條件易于控制；生長(zhǎng)迅速，發(fā)酵周期短；滿足代謝控制的要求；發(fā)酵工業(yè)對(duì)菌種的要求抗噬菌體和雜菌的能力強(qiáng)；遺傳性狀穩(wěn)定，不易變異退化；在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫要少，這對(duì)提高裝料系數(shù)、提高單產(chǎn)量、降低成本有重要意義；對(duì)需要添加的前體物質(zhì)有耐受能力，并且不能將這些前體作為一般碳源使用；不是病原菌，而且在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無關(guān)，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)。具備以上條件的微生物才能保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。二、發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求不是所有的微生物都能用于發(fā)酵工業(yè)，目前工業(yè)上能利用的微生物菌種只有區(qū)區(qū)數(shù)百種。工業(yè)上常用的微生物菌種：細(xì)菌：bacteria工業(yè)上常用的有枯草芽孢桿菌、醋酸桿菌、乳酸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌等，用于生產(chǎn)酶制劑、乳酸、醋酸等。酵母菌yeast工業(yè)上常用的酵母菌有啤酒酵母、假絲酵母、類酵母等，用于釀酒、制造面包、酶制劑和生產(chǎn)菌體蛋白。工業(yè)上常用的微生物菌種霉菌：mould工業(yè)上常用的霉菌有根霉、毛霉、紅曲霉、青霉等，主要生產(chǎn)酶制劑、抗生素、有機(jī)酸和甾體激素等。放線菌：actinomycetes

工業(yè)上常用的有鏈霉菌屬、小單胞菌屬和諾卡菌屬，主要用于生產(chǎn)多種抗生素。擔(dān)子菌：basidiomycetes

即常說的蕈菌，主要用于生產(chǎn)多糖、藥物開發(fā)。藻類：alga工業(yè)上常用的藻類有螺旋藻、單烈藻等，主要用于生產(chǎn)食品，替代能源等。發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育工業(yè)微生物的特點(diǎn)發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的分離和選育發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的退化、復(fù)壯與保藏三、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的

分離和選育工業(yè)生產(chǎn)使用的菌種，有兩種來源：根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購(gòu)買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。對(duì)于從自然界中分離篩選新的微生物菌種，必須制定相應(yīng)的策略，才能保證好的結(jié)果。三、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的

分離和選育（一）微生物菌種的分離（二）微生物菌種的選育（一）微生物菌種的分離自然界獲得的微生物樣品通常都是許多種微生物共存，必須把目標(biāo)菌種與雜菌分開，才能用于生產(chǎn)。目前進(jìn)行微生物分離的方法主要包括兩個(gè)：施加選擇性壓力分離法隨機(jī)分離法這兩種方法都是針對(duì)菌種從樣品中分離所采用的方法，實(shí)際發(fā)酵工業(yè)上菌種分離的步驟要有很多步驟。新種分離與篩選的步驟定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性。采樣：有針對(duì)性地采集樣品。增殖：人為的通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測(cè)定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營(yíng)養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。到目前為止，還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個(gè)試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過程中，應(yīng)及時(shí)調(diào)整檢測(cè)方法，以與各種不同類型的生長(zhǎng)和代謝之微生物相適應(yīng)。因此，建立更為科學(xué)的和針對(duì)性不強(qiáng)的分離方法是必要的。新種分離與篩選的步驟

（一）采樣1、采樣對(duì)象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。新種分離與篩選的步驟（一）采樣2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。新種分離與篩選的步驟（二）增殖培養(yǎng)為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多。新種分離與篩選的步驟（三）培養(yǎng)分離盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這一步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。新種分離與篩選的步驟施加選擇性壓力分離法施加選擇性壓力分離法：利用不同種類微生物生長(zhǎng)繁殖對(duì)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)要求不同，人為控制這些條件，使之利于某類或者某種微生物生長(zhǎng)，不利于其他微生物生存，以達(dá)到使目的菌占優(yōu)勢(shì)，從而快速分離純化的目的。此方法一般用于富集培養(yǎng)，即采集樣品后的第一步，可以使樣品中目標(biāo)微生物能大量繁殖。目前，分離培養(yǎng)基中也廣泛加入選擇性壓力因素，進(jìn)一步獲得目標(biāo)微生物。（四）篩選這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。新種分離與篩選的步驟（五）毒性試驗(yàn)自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國(guó)家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。新種分離與篩選的步驟不同微生物分離的方法細(xì)菌的分離放線菌的分離霉菌的分離

(一)采樣和采集方法為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時(shí)，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時(shí)所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。細(xì)菌的分離采樣的注意事項(xiàng)1、采樣時(shí)應(yīng)盡可能保持相對(duì)無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時(shí)間因素，因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的；5、采好的樣應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4℃下，但貯存時(shí)間不宜過長(zhǎng)。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會(huì)發(fā)生變化，微生物群體之間就會(huì)出現(xiàn)消長(zhǎng)細(xì)菌的分離土樣采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面5～15cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根際土樣時(shí)，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分即為根際土樣。植物體采集方法在采集葉面時(shí)，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。選擇葉面時(shí)應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時(shí)，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時(shí)，一般與根際土樣一起保存。

水樣采集方法用于細(xì)菌檢測(cè)的水樣應(yīng)收集于100ml干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，故在采樣時(shí)應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時(shí)應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測(cè)，或者4℃下貯存。玻璃水樣采集器不銹鋼水樣采集器卡蓋式水樣采集器培養(yǎng)基的組成原則1、加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量、環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中所要分離的細(xì)菌的數(shù)量和種類。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。3、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50μg／m1，以抑制真菌的生長(zhǎng)。4、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37℃培養(yǎng)箱中孵育l、2天。5、培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。培養(yǎng)基的組成原則土中細(xì)菌的富集培養(yǎng)與分離分離土樣中的大部分細(xì)菌的分離程序中無需進(jìn)行富集。但對(duì)某些少數(shù)細(xì)菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才能很好地被分離培養(yǎng)。運(yùn)用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長(zhǎng)因子的前體物質(zhì)來激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。富集可以促進(jìn)抗性的產(chǎn)生并維持下來。水中細(xì)菌富集技術(shù)在無菌的、用棉團(tuán)塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上；在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質(zhì)等，同樣可以促進(jìn)水中微生物的增殖。培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長(zhǎng)。另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細(xì)菌“附著材料”，如無菌的植物組織或土壤浸出液。通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細(xì)菌、中溫菌和嗜高溫菌。次代培養(yǎng)及純化步驟1、涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，如生長(zhǎng)出菌落，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對(duì)瓊脂平板進(jìn)行分類。2、用無菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上。3、篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長(zhǎng)出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素、菌落形態(tài)等進(jìn)行最初分組。4、將認(rèn)為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進(jìn)行篩選。不同微生物分離的方法細(xì)菌的分離放線菌的分離霉菌的分離放線菌的分離(一)采樣及采集方法應(yīng)盡可能實(shí)行無菌操作。所采集的樣本應(yīng)具有一定的代表性。樣本采集完后，應(yīng)及時(shí)處理或在4℃下貯存，貯存試樣處應(yīng)與劃線，篩選平板分開，貯存時(shí)間不宜過長(zhǎng)。(二)生態(tài)學(xué)參數(shù)放線菌分離培養(yǎng)過程中所需考慮的生態(tài)參數(shù)有溫度、pH、離子強(qiáng)度、氧化還原電勢(shì)和底物濃度。（三）培養(yǎng)基的組成原則大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱中存放3天。放線菌的分離放線菌的分離土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離：為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行稀釋和涂布。次代培養(yǎng)及純化菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過高倍放大進(jìn)行鏡檢，可了解氣生和營(yíng)養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識(shí)別不同的生長(zhǎng)形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時(shí)尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，以進(jìn)一步篩選和分離。不同微生物分離的方法細(xì)菌的分離放線菌的分離霉菌的分離真菌分離1、利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長(zhǎng)菌落分散，利于計(jì)數(shù)，分離和鑒定。這里主要是利用營(yíng)養(yǎng)成分的減少而使生長(zhǎng)減慢，并由此限制真菌的遷涉生長(zhǎng)。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離。3、有時(shí)，真菌子實(shí)體形成必須有光線，這在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加以考慮。4、選擇性富集：是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。

富集可以是種水平的，如通過營(yíng)養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標(biāo)微生物消除或減少到一定程度。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落形成。真菌分離真菌的分離方法土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過篩法，庶糖密度梯度離心法。植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。子實(shí)體直接分離培養(yǎng)擔(dān)子菌：新采集的子實(shí)體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無菌濾紙上培養(yǎng)。隨機(jī)分離法有些微生物在分離和篩選的時(shí)候并不是采用傳統(tǒng)的選擇性壓力分離法，只能采用隨機(jī)法進(jìn)行分離?？股禺a(chǎn)生菌的分離抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離抗病毒藥物產(chǎn)生菌的分離生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離免疫激活劑產(chǎn)生菌的分離多糖產(chǎn)生菌的分離抗生素產(chǎn)生菌的分離抗生素產(chǎn)生菌篩選方法包括：抑菌圈法、稀釋法、擴(kuò)散法、生物自顯影法等等。如抑菌圈法，由于抗生素產(chǎn)生菌會(huì)產(chǎn)生抗生素，因此事先在平板上涂抹適當(dāng)?shù)墓┰嚲▽?duì)抗生素敏感），如果待分離的微生物能夠在菌落周圍形成抑菌圈，即說明是具有抗生素產(chǎn)生能力的菌種。另外也可以采用專一性很強(qiáng)的篩選技術(shù)，如采用與抗生素作用機(jī)制相關(guān)的酶進(jìn)行篩選?？鼓[瘤藥物產(chǎn)生菌的分離大部分抗腫瘤藥物也具有抗菌和抗真菌活性，目前利用微生物篩選作用于DNA的抗腫瘤藥物的方法具有高靈敏度和簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，如生化誘導(dǎo)分析法和SOS生色檢測(cè)法。生化誘導(dǎo)分析法也叫λ誘導(dǎo)檢測(cè)法，通過測(cè)定表達(dá)的β-半乳糖苷酶活性，來檢測(cè)能損傷DNA的抗腫瘤藥物的存在。此外也可利用DNA修復(fù)能力突變株進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選。酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選，主要選擇與生理和病理關(guān)系明確的酶為靶酶進(jìn)行篩選。如可以用前列腺素合成酶、血管緊張素轉(zhuǎn)移酶等等作為靶酶，選擇產(chǎn)生酶抑制劑的微生物。三、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的

分離和選育（一）微生物菌種的分離（二）微生物菌種的選育（二）微生物菌種的選育工業(yè)菌種的育種：是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)某個(gè)用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。工業(yè)菌種的選育包括如下幾個(gè)方法：自然選育、誘變選育、抗噬菌體菌種選育、雜交育種、原生質(zhì)體融合技術(shù)和基因工程技術(shù)。1、自然選育不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過程叫自然選育。自然突變可能會(huì)產(chǎn)生兩種截然不同的結(jié)果，一種是菌種退化而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量或質(zhì)量下降，另一種是對(duì)生產(chǎn)有益的突變。自然選育的突變率雖然很低，但是卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施。自然選育還要注意生產(chǎn)菌種的回復(fù)突變。2、誘變選育利用各種被稱為誘變劑的物理因素和化學(xué)試劑處理微生物細(xì)胞，提高基因突變頻率，再通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。誘變育種包括誘變和篩選兩部分。誘變成功的關(guān)鍵，包括以下幾個(gè)步驟：出發(fā)菌株的選擇，一定要考慮目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)能力，其他因素盡量考慮利于誘變。誘變劑使用方法，有單一誘變劑和兩種以上的誘變劑聯(lián)合使用兩種方法。誘變劑的劑量選擇：誘變劑劑量與致死率有關(guān)系，同時(shí)與突變率有關(guān)系，所以一定要選擇合適的使用劑量。2、誘變選育2、誘變育種誘變處理結(jié)束之后，菌種有可能發(fā)生很多類型的變異，正向突變的菌種往往占少數(shù)，必須通過初篩和復(fù)篩之后在經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，確定最佳的條件，才能使高產(chǎn)菌株發(fā)揮生產(chǎn)能力，不同菌株可以根據(jù)特性不同采用不同的篩選方法，如營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种菩?、組成型突變株、抗性突變株等類型。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株由于生物合成途徑中某一步發(fā)生了酶缺陷，合成不能完成，末端產(chǎn)物不能積累，因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除。在培養(yǎng)基內(nèi)限量加入所要求的末端產(chǎn)物，克服生長(zhǎng)障礙，就能積累所需的中間產(chǎn)物。篩選時(shí)則可以利用這個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷作為條件，篩選出突變株。誘變、淘汰野生型、檢出缺陷型、確定生長(zhǎng)譜即為營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株誘變育種的基本步驟。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株育種過程淘汰野生型的方法：抗生素法：野生型能在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)短時(shí)讓野生型生長(zhǎng)，處于活化階段，而缺陷型無法生長(zhǎng)，仍處于休眠狀態(tài)。由于細(xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對(duì)于霉菌，因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而能濾過。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株育種過程營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出：原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)情況完全不同，缺陷型在CM上生長(zhǎng)良好，而在MM上則不生長(zhǎng)，野生型都能生長(zhǎng)。具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株育種過程生長(zhǎng)譜確定驗(yàn)證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長(zhǎng)譜測(cè)定。利用固體培養(yǎng)基，點(diǎn)不同的生長(zhǎng)因子，觀察菌種的生長(zhǎng)情況，來確定具體缺陷的因子?？狗答?zhàn)瓒艉涂狗答佉种菩涂狗答佔(zhàn)瓒艉涂狗答佉种剖侵改苁狗e累了大量末端產(chǎn)物的時(shí)候仍能不斷合成這一產(chǎn)物。篩選這類突變菌株是通過抗結(jié)構(gòu)類似物突變的方法完成的。未突變的細(xì)胞會(huì)因?yàn)榇x受阻，不能合成某種代謝產(chǎn)物而死亡，突變株仍能夠合成相應(yīng)的末端產(chǎn)物，形成菌落，便于區(qū)分。組成型突變株的篩選組成型突變株是為了解除菌株對(duì)誘導(dǎo)物的依賴而獲得的，因此可以選擇設(shè)計(jì)一種利于其生長(zhǎng)并限制誘導(dǎo)型菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，來達(dá)到篩選的效果。交替培養(yǎng)法就是篩選組成型突變株的有效方法。如β-半乳糖苷酶的組成型突變株和誘導(dǎo)性菌株就可以用這種方法區(qū)分?？剐酝蛔冎甑暮Y選這包括對(duì)抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體等的抗性篩選，這些突變株篩選都比較容易，在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)的因子，即可去除掉野生型菌株。如抗生素抗性突變株的篩選，即在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)抗生素，比如加入青霉素，野生型的不能生長(zhǎng)，而青霉素抗性突變株則可以生長(zhǎng)。其他的抗性突變株的篩選方法類似。3、雜交育種雜交育種：利用不同菌株之間遺傳物質(zhì)的交換、重組，使不同菌株的優(yōu)良性狀集中在重組體中，獲得新菌株的方法?？梢钥朔L(zhǎng)期誘變引起的生活力下降等缺點(diǎn)。雜交育種的優(yōu)點(diǎn)雜交育種的基本程序雜交育種的方法雜交育種的優(yōu)點(diǎn)可以通過育種使新菌株獲得多個(gè)菌株的優(yōu)良遺傳性狀；克服長(zhǎng)期誘變?cè)斐傻纳盍ο陆?，同時(shí)提高對(duì)誘變劑的敏感性，降低“疲勞”效應(yīng)；總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律，豐富并促進(jìn)遺傳學(xué)理論的發(fā)展。雜交育種的基本程序標(biāo)記親和力A+

B+

C-

D-標(biāo)記親和力A-

B-

C+

D+A+B+

C+

D+雜交育種的方法雜交育種的方法包括如下幾種：原核微生物：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)；真核微生物：有性生殖、準(zhǔn)性生殖。大部分發(fā)酵工業(yè)中具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的微生物是準(zhǔn)性生殖的方式進(jìn)行雜交重組。4、原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù)提供了充分利用遺傳重組雜交的方法，可以打破種屬之間的界限，提高重組頻率、擴(kuò)大重組幅度。原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性原生質(zhì)體融合的方法原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性受接合型或致育型的限制小，兩親株沒有供體和受體之分，有利于不同種屬微生物的雜交；重組頻率比其他的雜交方法高；遺傳物質(zhì)傳遞更加充分、完善，既有質(zhì)配也有核配；可以采用溫度、藥物、紫外線等處理純化菌株的一方或者雙方，然后再融合，提高篩選效率；用微生物的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，可明顯提高誘變頻率。原生質(zhì)體融合的方法原生質(zhì)體制備：使用各種酶降解兩個(gè)出發(fā)菌的細(xì)胞壁，釋放出原生質(zhì)體，同時(shí)釋放到高滲溶液中。原生質(zhì)體的融合與再生：通過化學(xué)因子或電場(chǎng)誘導(dǎo)進(jìn)行融合。如聚乙二醇4000和6000并加入Ca2+和Mg2+，融合之后涂布在高滲培養(yǎng)基上，令其再生。融合子的檢出：融合子在選擇性培養(yǎng)基上檢出，即通過兩個(gè)遺傳標(biāo)記互補(bǔ)確定的選擇性因素進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育工業(yè)微生物的特點(diǎn)發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的分離和選育發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的退化、復(fù)壯與保藏四、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的退化、復(fù)壯與保藏微生物世代時(shí)間一般很短暫，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此常常造成工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化，甚至可能使優(yōu)良菌種丟失，所以如何保持菌種的優(yōu)良性能和穩(wěn)定成為關(guān)鍵。（一）微生物菌種的退化及原因（二）防止菌種退化及退化菌種的復(fù)壯（三）菌種的保藏（一）微生物菌種的退化及原因菌種退化：指在經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間傳代保藏之后，菌株的一個(gè)或多個(gè)生理性狀和形態(tài)特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。引起菌種退化的原因：基因突變變異菌株性狀分離連續(xù)傳代其他因素（二）防止菌種退化及退化

菌種的復(fù)壯防止菌種退化的方法：控制傳代次數(shù)：盡量避免不必要的接種和傳代，在傳代的時(shí)候盡量同時(shí)移植較多斜面菌種；選擇合適的培養(yǎng)條件：選擇一個(gè)適合原種生長(zhǎng)的條件可防止菌種的衰退；利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代：特定的菌株采用特定的細(xì)胞形式進(jìn)行傳代；選擇合適的保藏方法。（二）防止菌種退化及退化

菌種的復(fù)壯退化菌種的復(fù)壯：使退化的菌種重新回復(fù)原來的優(yōu)良特征，叫做復(fù)壯。常用的方法是對(duì)已退化的菌株用一定的培養(yǎng)條件進(jìn)行單細(xì)胞的分離純化，從而限制退化菌株在數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)。（三）菌種的保藏菌種保藏的意義菌種保藏的原理菌種保藏的方法：斜面低溫保藏法石蠟油封保藏法砂土管保藏法冷凍干燥法超低溫保藏法冷凍干燥設(shè)備液氮設(shè)備發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育工業(yè)微生物的特點(diǎn)發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的分離和選育發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的退化、復(fù)壯與保藏第二節(jié)工業(yè)微生物種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入固體試管斜面活化后，再經(jīng)過搖瓶或者靜置培養(yǎng)，以及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大而獲得發(fā)酵量高、生產(chǎn)性能穩(wěn)定、數(shù)量充足、不備雜菌和噬菌體污染的生產(chǎn)菌種的純種制備過程。該純種培養(yǎng)物即稱為種子。種子必須滿足一些條件才能進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵：總量適宜進(jìn)行發(fā)酵，生命力旺盛，能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)性能，無雜菌和噬菌體的污染。工業(yè)微生物種子的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)種子制備的過程發(fā)酵工業(yè)種子培養(yǎng)影響種子培養(yǎng)的因素和種子質(zhì)量的控制一、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)就是要為每只發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短與接種量的大小直接有關(guān)系，因此在種子擴(kuò)大培養(yǎng)中必須獲得純而壯的種子，而且還要獲得活力旺盛的接種量足夠的培養(yǎng)物。具體接種量的大小要根據(jù)具體的發(fā)酵過程采用的菌種確定。工業(yè)微生物種子的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)種子制備的過程發(fā)酵工業(yè)種子培養(yǎng)影響種子培養(yǎng)的因素和種子質(zhì)量的控制二、種子制備的過程種子的制備過程分為兩個(gè)層次：實(shí)驗(yàn)室種子制備生產(chǎn)車間種子制備二、種子制備的過程1、實(shí)驗(yàn)室種子制備實(shí)驗(yàn)室種子制備包括瓊脂斜面培養(yǎng)、固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)和搖瓶液體培養(yǎng)等，目的是為種子罐提供種子。根據(jù)菌種的生理特性不同，提供給種子罐的菌種狀態(tài)也不同，如產(chǎn)孢能力強(qiáng)的菌種、產(chǎn)孢能力弱的菌種、不產(chǎn)生孢子的細(xì)菌、酵母菌等。實(shí)驗(yàn)室階段培養(yǎng)過程中，因?yàn)榫N和培養(yǎng)基的量較少，所以可以在無菌狀態(tài)下直接接入，不用采用其他輔助條件。二、種子制備的過程種子的制備過程分為兩個(gè)層次：實(shí)驗(yàn)室種子制備生產(chǎn)車間種子制備2、生產(chǎn)車間種子制備種子罐培養(yǎng)基：種子罐中應(yīng)采用易被微生物吸收利用的成分為主，同時(shí)供給足夠的無菌空氣，最后一級(jí)種子罐培養(yǎng)基還應(yīng)與發(fā)酵罐培養(yǎng)基基本一致；種子罐接種：孢子懸浮液采用微孔接種法，搖瓶菌絲體采用火焰保護(hù)接種或者壓差法，種子罐之間采用壓差法接種；種子罐級(jí)數(shù)：是指制備種子需要逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，決定于菌種特性和發(fā)酵罐容積；微孔壓差法接種接種針（含菌懸液或孢子懸液）插入，壓力由0.5－0.6kg/cm2降至0.2kg/cm2

，當(dāng)針插入橡皮塞后，茄子瓶與發(fā)酵罐壓力平衡，降低罐壓，使懸液注入。特點(diǎn)：操作方便，不易染菌，但不宜于菌絲體種子的接種。2、生產(chǎn)車間種子制備菌種的種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體轉(zhuǎn)移下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間，一般采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且培養(yǎng)液中菌體數(shù)量還未達(dá)到最高峰時(shí)為宜。種子罐和發(fā)酵罐的接種量：接種量是指移入的種子液體體積和接種后培養(yǎng)基體積的比例。接種量的大小取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)繁殖的速度。工業(yè)微生物種子的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)種子制備的過程發(fā)酵工業(yè)種子培養(yǎng)影響種子培養(yǎng)的因素和種子質(zhì)量的控制三、發(fā)酵工業(yè)種子培養(yǎng)靜置培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法深層培養(yǎng)法的基本操作控制點(diǎn)常用的液體深層培養(yǎng)法種子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法表面培養(yǎng)法：是一種好氧靜置培養(yǎng)法，分液體和固體培養(yǎng)。氧的供給是發(fā)酵的限速原因，優(yōu)點(diǎn)是不需要深層培養(yǎng)時(shí)的攪拌和通氣，節(jié)省動(dòng)力。固體培養(yǎng)法：分為淺盤固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng)，統(tǒng)稱曲法培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)基組成簡(jiǎn)單，不易被細(xì)菌污染，容易調(diào)節(jié)通氣狀況。種子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法液體深層培養(yǎng)：從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解，稱為深層培養(yǎng)法。載體培養(yǎng)法：來源于曲法培養(yǎng)，同時(shí)吸收了液體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，特征是以天然或