第九章-維生素類藥物的分析

第九章維生素類藥物的分析概述維生素：是維持人體正常代謝機(jī)能所必需的微量營養(yǎng)物資。人體不能合成維生素。

公元前3500年-古埃及人發(fā)現(xiàn)能防治夜盲癥的物質(zhì)，也就是后來的維A。

1600年-醫(yī)生鼓勵(lì)以多吃動(dòng)物肝臟來治夜盲癥。

1747年-蘇格蘭醫(yī)生林德發(fā)現(xiàn)檸檬能治壞血病，也就是后來的維C。

1831年-胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)。

1905年-甲狀腺腫大被碘治愈。

1911年-波蘭化學(xué)家豐克為維生素命名。

1915年-科學(xué)家認(rèn)為糙皮病是由于缺乏某種維生素而造成的維生素發(fā)展史1916年-維生素B被分離出來。

1917年-英國醫(yī)生發(fā)現(xiàn)魚肝油可治愈佝僂病，隨后斷定這種病是缺乏維D引起的。

1920年-發(fā)現(xiàn)人體可將胡蘿卜轉(zhuǎn)化為維生素A。

1922年-維E被發(fā)現(xiàn)。

1928年-科學(xué)家發(fā)現(xiàn)維B至少有兩種類型。

1933年-維E首次用于治療。

1948年-大劑量維C用于治療炎癥。

1949年-維B3與維C用于治療精神分裂癥。

1954年-自由基與人體老化的關(guān)系被揭開。

1957年-Q10多酶被發(fā)現(xiàn)。

1969年-體內(nèi)超級(jí)抗氧化酶被發(fā)現(xiàn)。

1970年-維C被用于治療感冒。

1993年-哈佛大學(xué)發(fā)表維生素E與心臟病關(guān)系的研究結(jié)果。VitA、D2、D3、E、K1等脂溶性水溶性VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、葉酸、煙酸、泛酸等。分類按溶解度分第一節(jié)維生素A的分析一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)（一）結(jié)構(gòu)R:-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯一個(gè)共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯，有立體異構(gòu)體相對(duì)生物效價(jià)維生素A325.5100%新維生素Aa32875%新維生素Ab320.524%新維生素Ac310.515%異維生素Aa32321%異維生素Ab32424%（二）性質(zhì)1、具紫外吸收：在325～328nm間有最大吸收2、不穩(wěn)定性：（易氧化變質(zhì)）

易被空氣中氧或氧化劑氧化易被紫外光裂解在加熱和金屬離子存在時(shí)，更易氧化變質(zhì)，生物活性的環(huán)氧化物、維生素A醛及維生素A酸△或有金屬離子存在時(shí)氧化↑3、能與三氯化銻呈色：產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍(lán)色。4、溶解性：維生素A能與氯仿、乙醚、環(huán)己烷或石油醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶二、鑒別試驗(yàn)（一）三氯化銻反應(yīng)原理：維生素A在飽和無水三氯化銻的無醇氯仿溶液中，即顯藍(lán)色，漸變成紫紅色。注意：鑒別在無水、無醇條件下進(jìn)行。CHCl3水中水解為氯化氧銻（二）紫外吸收光譜：

5個(gè)共軛雙鍵6個(gè)共軛雙健去水VitA（VitA3）↓VitA（三）薄層色譜吸附劑：硅膠G展開劑：環(huán)己烷-乙醚(80:20)點(diǎn)樣量：各2μl，不必?fù)]散溶劑，立即展開顯色劑：三氯化銻溶液結(jié)論：比較供試品溶液和對(duì)照品溶液所顯藍(lán)色斑點(diǎn)位置BP雜質(zhì)對(duì)照品法顯色劑三氯化銻USP顯色劑磷鉬酸規(guī)定斑點(diǎn)顏色和Rf值立體異構(gòu)體氧化降解產(chǎn)物合成中間體副產(chǎn)物UV法（一）三、含量測(cè)定維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸三點(diǎn)校正法1、方法建立的依據(jù)2、測(cè)定原理方法的依據(jù)：★主成分：在325～328nm有吸收★雜質(zhì)：在310～340nm范圍內(nèi)吸收呈一條直線，且隨波長的增大，吸收度變小?！镂镔|(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性。3、三點(diǎn)波長的選擇（1）第1點(diǎn)：選擇維生素A的最大吸收波長(λ1)（2）第2點(diǎn)和第3點(diǎn)：在λmax兩側(cè)各選一點(diǎn)①等波長差法：λ3-λ1=λ1-λ2測(cè)定VA醋酸酯，規(guī)定：λ1=328nm，入2=316nm，λ3=340nm②等吸收度法：Aλ2=Aλ3=6/7Aλ1測(cè)定VA醇，規(guī)定：λ1=325nm，λ2=310nm,λ3=334nm4、雜質(zhì)吸收(1)維生素A2和維生素A3(2)維生素A的氧化產(chǎn)物環(huán)氧化物、維生素A醛和維生素A酸。(3)維生素A在光照下產(chǎn)生的無生物活性的聚合物鯨醇。(4)維生素A的異構(gòu)體。(5)合成時(shí)產(chǎn)生的中間體。(1)～(5)這些雜質(zhì)在310～340nm波長范圍內(nèi)有吸收，因此，在測(cè)定維生素A含量時(shí)，必須考慮這些雜質(zhì)的干擾。三點(diǎn)校正法可以消除這些雜質(zhì)的影響。5、測(cè)定方法（1）基本步驟:第一步A的選擇選擇依據(jù)：所選A值中雜質(zhì)的干擾已被基本消除第二步：求百分吸收系數(shù)，

注意：

C為混合樣品的濃度第三步求效價(jià)換算因數(shù)由純品計(jì)算而得：第四步：求標(biāo)示量％(2)第一法—等波長差法，高純度VA醋酸酯

測(cè)量方法：計(jì)算各波長下的吸收度與328nm波長下的吸收度的比值

判斷是否在326～329nm之間在326～329nm之間改用第二法是否

求算并與規(guī)定值比較

規(guī)定值差值

判斷前提；最大吸收波長在326～329nm之間A的選取直接用A328A328

A328校正

第一法不適用

03%－15%－3%第二法第二法討論VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直線方程式法（即代數(shù)法）推導(dǎo)而來；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（幾何法或稱6/7定位法）推導(dǎo)而來。在應(yīng)用三點(diǎn)校正法時(shí)，除其中一點(diǎn)在最大吸收波長處測(cè)定外，其余兩點(diǎn)均在最大吸收峰的兩側(cè)進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)定前務(wù)必要校正波長。測(cè)定的樣品應(yīng)不得少于兩份。例：VitAD膠丸中VitA的含量測(cè)定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項(xiàng)下（平均裝量0.08262g/丸）的內(nèi)容物0.2399g至250ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一20ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測(cè)定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測(cè)得吸收度為

求本品中維生素A的含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.833A360/A328：0.344

0.5550.9071.0000.8110.299+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====用校正的吸收值（3）第二法—等吸收度法，適用于維生素A醇[皂化法、6/7A法]第一法無法消除雜質(zhì)干擾時(shí)用此法加熱回流

判斷

max是否在323～327nm之間取未皂化樣品采用色譜法純化后再測(cè)定

計(jì)算是否03%－3%二、三氯化銻比色法優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便快速λmax618nm～620nm標(biāo)準(zhǔn)曲線法缺點(diǎn)呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性（三）高效液相色譜法RP-HPLC同時(shí)測(cè)定人血清中VitA和VitE的含量1、儀器與分析條件：HPLC-UV、C18(300×3.9mm）、甲醇－水（96：4）、流速：1.2ml/min、檢測(cè)波長：0～8min(330nm),8min后(292nm）內(nèi)標(biāo)：維生素A醋酸酯血清樣品的制備：LLE法制備分析方法的建立：線性LODRecoveryPrecisionChromatogram:第二節(jié)維生素Bl的分析一、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)(一)結(jié)構(gòu)氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨堿)HClCl-存在于米糠、麥麩和酵母中人工合成(二)性質(zhì)（1）溶解性：在水中易溶，水溶液顯酸性在乙醇中微溶，在乙醚中不溶（2）具有紫外吸收：λmax=246nm（HCl溶液）（3）硫色素反應(yīng)：具有熒光（4）堿性

可與酸成鹽

與生物堿沉淀試劑反應(yīng)，生成組成恒定的沉淀。

含量測(cè)定——非水堿量法

（5）氯化物特性嘧啶環(huán)—伯氨噻唑環(huán)—季銨碘化汞鉀、三硝基酚、碘溶液、硅鎢酸等二、鑒別試驗(yàn)(一)硫色素反應(yīng)——維生素B1的專屬反應(yīng)原理：方法：VitB1H+H+H+H+（二）沉淀反應(yīng)S元素反應(yīng)Cl-反應(yīng)（三）其他反應(yīng)()21PbSNaSVitBNO3PbNaOH三、含量測(cè)定非水溶液滴定法（原料）和紫外分光光度法（制劑）、硫色素?zé)晒夥ǎ║SP（24））。（一）非水滴定法1、原理：含有兩個(gè)堿性的已成鹽的伯胺和季銨基團(tuán)，在非水溶液中可與高氯酸作用，用于含量測(cè)定。

喹那啶紅－亞甲藍(lán)（紫紅→天藍(lán)）2、方法：用冰醋酸作溶劑，滴加醋酸汞，以喹哪啶紅—亞甲藍(lán)混合物作指示劑，高氯酸作滴定液3、注意事項(xiàng)：（1）加醋酸汞。（2）滴定度為16.86mg/ml。VB1有兩個(gè)堿性基團(tuán)，與高氯酸反應(yīng)的摩爾比為1︰2（3）非水容量法可用于弱酸性特別是弱堿性藥物及其鹽類的含量測(cè)定。（4）此處僅適用于維生素B1的原料藥含量測(cè)定。（二）紫外分光光度法1、原理：2、VB1片的含量測(cè)定

測(cè)定方法：

以鹽酸溶液(9→1000)作溶劑，在246nm測(cè)定吸收度，按Cl2Hl7ClN4OS·HCl的吸收系數(shù)(百分吸收系數(shù))為421計(jì)算，即得。

片劑、注射劑=421（每片）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=A=ECL規(guī)格g/片g/100mlgChP（每ml）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=規(guī)格g/mlml（三）硫色素?zé)晒夥ㄔ?、熒光硫色素異丁醇鐵氰化鉀1VitBNaOH通過與對(duì)照品熒光強(qiáng)度的比較即可測(cè)得供試品含量2、實(shí)驗(yàn)操作40ml具塞試管3支→對(duì)照品溶液5ml；其中2支加入氧化試劑3.0ml，再迅速加入異丁醇20ml，振搖。第三支試管中加入3.5mol/l的NaOH，同法操作為空白。另取三支試管加入供試品，同法操作。各試管中加入無水乙醇2ml，分取異丁醇，進(jìn)行熒光測(cè)定。3、結(jié)果計(jì)算特點(diǎn)4、（1）靈敏度高，線性范圍寬（2）代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析（3）該法適用于VitB1的制劑含量分析（4）可用BrCN為氧化劑，反應(yīng)定量完全，適合于生物樣本分析第三節(jié)維生素C的分析有四種光學(xué)異構(gòu)體，其中以L-構(gòu)型右旋體的生物活性最強(qiáng)。藥典：維生素C原料、片劑、泡騰片、顆粒劑和注射劑一、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)(一)結(jié)構(gòu)

具有烯二醇結(jié)構(gòu)和內(nèi)酯環(huán)

在C4、C5有兩個(gè)手性碳原子

性質(zhì)活潑

具有旋光性（二）性質(zhì)1、溶解性：

水中易溶

乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶

水溶液呈酸性C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.572、具有酸性一元酸（與碳酸氫鈉成鹽）烯二醇結(jié)構(gòu)（抗壞血酸）二酮基結(jié)構(gòu)（去氫抗壞血酸）烯二醇結(jié)構(gòu)3、強(qiáng)還原性[o]-2H+2H有活性有活性無活性L-二酮古洛糖酸L(+)－抗壞血酸活性最強(qiáng)手性C（C4、C5）4、光學(xué)活性**與堿反應(yīng)5、水解反應(yīng)內(nèi)酯環(huán)△糖類的顯色反應(yīng)50℃結(jié)構(gòu)與糖類相似6、具糖的性質(zhì)7、UV特征二、鑒別試驗(yàn)（一）利用VC所具有的強(qiáng)還原性1、與硝酸銀反應(yīng)(1)方法：取本品0.2g，加水l0ml溶解。取該溶液5m1，加硝酸銀試液0.5m1，即生成銀的黑色沉淀。(2)原理：烯二醇基，具強(qiáng)還原性

2、與2，6—二氯靛酚反應(yīng)(1)方法：取本品0.2g，加水l0ml溶解。取該溶液5m1，加2，6—二氯靛酚試液1～2滴，試液的顏色即消失。原理：氧化型玫瑰紅色還原型藍(lán)色OHˉ3、與其他氧化劑反應(yīng)亞甲藍(lán)或高錳酸鉀試劑褪色

堿性酒石酸銅磚紅色沉淀

磷鉬酸鉬藍(lán)

或鹽酸吡咯50℃（二）利用維生素C所具有糖類性質(zhì)的反應(yīng)

H+吡咯（三）利用VC所具有的紫外吸收特性維生素C在0.0lmol/L鹽酸液中，在243nm波長處有惟一的最大吸收，利用此特征進(jìn)行鑒別。BP中采用該法，并規(guī)定其吸收系數(shù)應(yīng)為545～585之間三、雜質(zhì)檢查1.溶液的澄清度與顏色：有色雜質(zhì)分光光度法

2.鐵、銅離子：原子吸收分光光度法三、含量測(cè)定具有較強(qiáng)的還原性，可被不同氧化劑定量氧化的性質(zhì)。（一）碘量法1、原理指示劑淀粉指示液H+取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6方法2、3、討論①防止樣品氧化減慢VitC被O2氧化速度②用新沸冷水作溶劑趕走水中O2③應(yīng)用范圍廣對(duì)維生素C原料、維生素C片、維生素C泡騰片、維生素C注射液、維生素C顆粒劑等的含量測(cè)定均采用。差別僅在前處理：為了消除制劑中輔料對(duì)測(cè)定的干擾，滴定前要作些必要的處理2，6-二氯靛酚鈉滴定法法（二）USPJP原理1、酚亞胺二氯靛酚，-62VitC自身指示終點(diǎn)法方法2、（2）快速滴定2min內(nèi)

（1）酸性環(huán)境HPO3-HAc

穩(wěn)定VitC防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）剩余比色測(cè)定

（定量過量）（測(cè)剩余染料）討論3、（4）缺點(diǎn)

需經(jīng)常標(biāo)定貯存≤一周不穩(wěn)定干擾多氧化力較強(qiáng)三、高效液相色譜法人血漿中VitC濃度的HPLC法測(cè)定1、色譜條件2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備3、血漿樣品的處理：酸性溶液沉淀蛋白法4、方法學(xué)考察5、測(cè)定第四節(jié)維生素D的分析－－是抗佝僂病維生素的總稱。收載有：維生素D2、D3原料藥、維生素D2膠丸和注射劑、維生素D3注射劑等維生素D3－膽骨化醇一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)維生素D2－骨化醇24性質(zhì)：1、脂溶性：在植物油中略溶，水中不溶2、不穩(wěn)定性：含有多個(gè)烯鍵，不穩(wěn)定，易氧化變質(zhì)降低效價(jià)，毒性增加3、旋光性：維生素D2有6個(gè)手性碳原子維生素D3有5個(gè)手性碳原子4、顯色反應(yīng)：甾醇類化合物共有5、紫外吸收特性二、鑒別試驗(yàn)1.顯色反應(yīng)醋酐-硫酸反應(yīng)D2黃紅紫綠D3黃紅紫、藍(lán)綠綠三氯化銻反應(yīng)橙紅色漸變粉紅三氯化鐵反應(yīng)橙黃色二氯丙醇和乙酰氯反應(yīng)綠色漸變漸變迅即迅即2.比旋度鑒別維生素D2維生素D3溶劑

濃度比旋度值無水乙醇無水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°+105°～+112°注意事項(xiàng)：應(yīng)于容器開啟30分鐘內(nèi)取樣在溶液配制后30分鐘內(nèi)測(cè)定3.區(qū)別反應(yīng)：

以96%乙醇為溶劑，加乙醇和85%硫酸D2顯紅色，在570nm處有最大吸收D3顯黃色，在495nm處有最大吸收4.其他方法：TLC、HPLC、制備衍生物測(cè)熔點(diǎn)

三、雜質(zhì)檢查維生素D2中麥角甾醇的檢查：加洋地黃皂苷溶液，混合，放置18h不得發(fā)生渾濁或沉淀。前維生素D的光照產(chǎn)物四、含量測(cè)定方法中國藥典采用正相高效液相色譜法(NP-HPLC）