第七章 體內(nèi)藥物濃度法(已修改)

第二章體內(nèi)藥物濃度法

第一節(jié)體內(nèi)藥物濃度測定樣本與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的選擇第二節(jié)建立中藥體內(nèi)藥物濃度測定方法的技術(shù)要求第三節(jié)常用的中藥體內(nèi)藥物濃度測定方法

第一節(jié)測定樣本與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的選擇

對(duì)于有效成分明確且有效成熟的定量分析方法測定的中藥，可采用此法。一、測定樣本常用的測定樣本有：血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、淚液（眼用制劑）、乳汁（乳汁排除藥物對(duì)乳兒的影響）、臟器勻漿等.二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇1、盡可能與藥理學(xué)、毒理學(xué)研究一致，以便聯(lián)系藥效學(xué)進(jìn)行分析討論。2、最好從同一只動(dòng)物多次采樣，采樣時(shí)間為自變量，必須準(zhǔn)確，操作迅速。3、小鼠、大鼠、兔（口服不用）、犬較為常用。第二節(jié)測定方法的技術(shù)要求

一、靈敏度高血藥濃度常在ng/ml級(jí)。二、專一性強(qiáng)能排除藥物代謝產(chǎn)物及機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。三、準(zhǔn)確度高，精密度高四、快速、簡便第三節(jié)常用的中藥體內(nèi)藥物濃度測定方法

一、分光光度法（一）紫外分光光度法（二）熒光分光光度法（三）原子吸收光譜法

二、色譜法（一）薄層層析（TLC）法（二）高效液相（HPLC）法（三）氣相色譜（GC）法高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是在經(jīng)典液相色譜和氣象色譜的理論與技術(shù)上發(fā)展起來的一種現(xiàn)代化色譜分析方法。該法由于采用高效固定相、高壓輸液泵、高靈敏檢測器等新技術(shù)，從而成為色譜法中應(yīng)用最為廣泛的一種分析方法。具有樣品適用范圍廣，預(yù)處理簡單，快速，靈敏，專一等優(yōu)點(diǎn)。

1.HPLC法的選擇

高效液相色譜法的種類較多，包括液-固吸附色譜法、液-液分配色譜法（正相或反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法、凝膠色譜法。選擇色譜方法必須考慮所分離化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和溶解度。關(guān)于選擇各類高效液相色譜法的原則見下圖。

樣品分子量<1000溶于有機(jī)溶劑溶于水非極性液、液分配色譜(反相)化學(xué)鍵合相C18甲醇-水乙腈-水中等極性液、固吸附色譜硅膠5~100μ乙烷-極性溶劑強(qiáng)極性液、液分配色譜(正相)YWG-NH2二氯甲烷等非離子型離子型液、液分配色譜(反相)化學(xué)鍵合相C18甲醇-水乙腈-水陰離子交換PartisilSAX磷酸鹽緩沖液離子對(duì)色譜化學(xué)鍵合相C18甲醇-水（含反離子）陽離子交換PartisilSCX磷酸鹽緩沖液分子量>10000凝膠色譜2.檢測器的分類及選擇

紫外檢測器（UVD）：主要有以下幾種類型：①固定波長型：用得較多的是波長為254nm的紫外光。因大多數(shù)芳香族、芳雜環(huán)、稠芳環(huán)等在此處均有吸收。②可調(diào)波長型：相當(dāng)于一臺(tái)紫外可見分光光度計(jì)。由于波長可任意調(diào)整，可以選擇試樣的最大吸收波長進(jìn)行檢測，提高靈敏度。③掃描型：不僅可選擇波長，還有快速掃描裝置，記錄組分的吸收光譜，使定性分析更方便。④光電二極管陣列型：一次操作可獲得包括波長、吸收值和時(shí)間在內(nèi)的三維譜圖，還可得到難分離組分重疊峰的有關(guān)信息。熒光檢測器（FLD）：相當(dāng)于一臺(tái)熒光光度計(jì)?；谀承晒馕镔|(zhì)吸收一定波長紫外光后發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。

蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）：其基本原理是樣品氣化后，溶質(zhì)粒子的散射光強(qiáng)度與其濃度成正比。此外還有視差折光檢測器、電化學(xué)檢測器等。

3.樣品預(yù)處理技術(shù)（1）試樣的預(yù)處理：生物樣品中含有蛋白質(zhì)和其它干擾物質(zhì)，處理不好直接影響柱子的壽命和柱效。另外體液中藥物及代謝產(chǎn)物含量很低，還需盡可能加以濃縮。①除去蛋白質(zhì)等其它干擾物質(zhì)，加入沉淀劑改變蛋白質(zhì)等電點(diǎn)②溶劑提取法酸性物質(zhì)酸化然后用與水不相溶的溶劑堿性物質(zhì)堿化提取表（7-16）列出了一般藥品的提取方法。表7-16一般藥品提取方法樣品性質(zhì)提取方法水溶性樣品1.酸性藥物及其鹽有機(jī)溶劑提取雜質(zhì)后調(diào)成酸性,再加入有機(jī)溶劑提取,或在N2流吹下,用適當(dāng)溶劑溶解后進(jìn)樣。2.堿性藥物及其鹽有機(jī)溶劑提取雜質(zhì)后調(diào)成堿性，再加入有機(jī)溶劑提取，可直接進(jìn)樣，或在N2流下吹干，用適當(dāng)溶劑溶解后進(jìn)樣。

3.中性藥物有機(jī)溶劑提取后，直接用反相色譜法分析。脂溶性樣品有機(jī)溶劑提取后，或進(jìn)樣，或在N2流下吹干，用適當(dāng)溶劑溶解后進(jìn)樣。

③薄層色譜或預(yù)柱色譜分離活性碳氧化鋁填充劑離子交換樹脂等④膜過濾法：以一定大小孔徑的微孔膜，除去一定分子量以上的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、細(xì)胞等。

（2）衍生物制備：對(duì)于無紫外和熒光吸收的藥物可采用化學(xué)衍生法。將樣品經(jīng)過簡單的處理，引入對(duì)紫外或熒光吸收性強(qiáng)的發(fā)色團(tuán)，使其生成在紫外區(qū)有強(qiáng)吸收或能發(fā)射熒光的衍生物，提高檢測靈敏度和選擇性。包括柱前和柱后衍生。

柱前衍生：將樣品制備成衍生物后再進(jìn)樣，此法不改變儀器結(jié)構(gòu)，但分離度較差；柱后衍生：色譜柱流出液與反應(yīng)液柱后混合，反應(yīng)后再進(jìn)入檢測器。此法需改變儀器結(jié)構(gòu)，但分離度高。例如：十二烷基硫磺酸鈉作膠束試劑使延胡索乙素的熒光強(qiáng)度增大5.5倍。

-CD包合物增敏熒光法可降低秦皮甲、乙素的最低檢出濃度，進(jìn)行微量痕量檢測。

4.常見定量法（1）歸一化法：將樣品中所有出峰組分含量之和作為100%，求出其中某一組分含量百分?jǐn)?shù)的方法。計(jì)算公式為：…

其中Ci%：i組分的重量百分含量

fi：

i組分的校正因子（由于檢測器對(duì)各組分的靈敏度不同，同樣濃度在色譜圖上呈現(xiàn)的面積并不相同，因此應(yīng)校正。fi可通過有關(guān)手冊查到。）

歸一化法

優(yōu)點(diǎn)：方法簡便，結(jié)果比較準(zhǔn)確，定量結(jié)果與進(jìn)樣量無關(guān)，操作條件變化對(duì)結(jié)果影響較小。

缺點(diǎn)：所有組分都必須在在操作時(shí)間內(nèi)流出色譜柱，且檢測器對(duì)它們都產(chǎn)生信號(hào)。

（2）內(nèi)標(biāo)法：

是指向樣品溶液中準(zhǔn)確加入一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行液相分析，根據(jù)樣品和內(nèi)標(biāo)物的重量及其相應(yīng)的峰面積之比，求出待測組分含量。

測定方法：準(zhǔn)確稱量樣品M克，取一純物質(zhì)（內(nèi)標(biāo)物）適量Ms，加入樣品中，混勻，進(jìn)樣。根據(jù)待測組分i的峰面積（Ai）及內(nèi)標(biāo)物的峰面積（As），依據(jù)下列關(guān)系可求出樣品中i組分的百分含量Ci%。

因?yàn)樗詫?duì)內(nèi)標(biāo)物的要求：①內(nèi)標(biāo)物在結(jié)構(gòu)上或官能團(tuán)類型上與被測組分相似，但應(yīng)為原樣品中所不含有的組分，否則會(huì)使峰重疊而無法準(zhǔn)確測量內(nèi)標(biāo)物的峰面積。②內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間應(yīng)與待測組分相近，但能完全分開。③內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。

內(nèi)標(biāo)法具備歸一化法的優(yōu)點(diǎn)，只要被測組分與內(nèi)標(biāo)物產(chǎn)生信號(hào)即可定量，結(jié)果比較準(zhǔn)確，不需準(zhǔn)確進(jìn)樣，很適合于中草藥及其復(fù)方某些有效成分的血藥濃度測定。

缺點(diǎn)：每次分析都要準(zhǔn)確稱量樣品和內(nèi)標(biāo)物的重量，而且理想的內(nèi)標(biāo)物不易尋找。（3）外標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)物不易選定時(shí)，可用外標(biāo)法。外標(biāo)法又分工作曲線法與外標(biāo)一點(diǎn)法等。

工作曲線法：配制欲定量組分對(duì)照品一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確進(jìn)樣，測量其峰高或峰面積。以峰高或峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液的濃度繪制工作曲線。然后再按相同操作條件進(jìn)行樣品測定，測出待測組分的峰高或峰面積，利用工作曲線定量。

外標(biāo)一點(diǎn)法：工作曲線法計(jì)算含量時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩種情況：標(biāo)準(zhǔn)曲線過原點(diǎn)，截距為零；標(biāo)準(zhǔn)曲線不過原點(diǎn)，截距不為零，說明系統(tǒng)存在誤差。當(dāng)截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量。CCAA

定義：用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同量進(jìn)樣多次，算出峰面積平均值，然后取樣品溶液在相同條件下操作，所測得的峰面積按下式計(jì)算含量：外標(biāo)一點(diǎn)法要求進(jìn)樣量準(zhǔn)確及測試條件恒定。實(shí)例1

兔血漿中丹皮酚的高效液相色譜法測定

[按]

本例采用HPLC內(nèi)標(biāo)測定法，請(qǐng)注意內(nèi)標(biāo)物苯乙酮選擇的基本要求：其在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被測物質(zhì)丹皮酚相似，但又非原樣品中所含有的組分，兩者的保留時(shí)間相近，但又能完全分開。因丹皮酚具有揮發(fā)性，故在血樣處理時(shí)采用了乙腈沉淀法。結(jié)果較為滿意，可供類似成分藥物動(dòng)力學(xué)研究參考。

1.實(shí)驗(yàn)部分

1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取丹皮酚4mg置25ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度(0.16mg/ml)。分別吸取5、10、20、40、80、120μl置具塞離心管中，分別加入苯乙酮溶液15μl；加兔血漿1ml，乙腈5ml，補(bǔ)加蒸餾水至8ml，混勻，離心(2000r/min)15min。上層液通過SPEC18，取收集液進(jìn)樣20μl，測量峰高，計(jì)算丹皮酚與苯乙酮的峰高比。用最小二乘法回歸，得濃度對(duì)峰高比的回歸方程為：1.2兔血漿中丹皮酚濃度的測定

丹皮酚溶液的制備：稱取丹皮酚300mg，以無水乙醇10ml溶解，再加1,2-丙二醇7ml混合。此液逐漸加到滅菌蒸餾水中至30ml，過濾。濾液于100℃，30min滅菌即得。

Y=15.151X-0.00382(n=6)，r=0.9973

選擇體重在2.5kg以上NewZaland兔3只，按30mg/kg由耳靜脈注射丹皮酚溶液，然后在2、5、15、20、30、45、60、90、120、180、240和360min時(shí)取血，并立即離心(2000r/min)10min，分離血漿。

分別取上述各時(shí)間的血漿1ml，置具塞離心管中，加乙腈5ml，苯乙酮溶液15μl，混合后補(bǔ)加蒸餾水至8ml，混合。其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下。測定丹皮酚與內(nèi)標(biāo)物的峰高比，代入回歸方程計(jì)算血藥濃度（見表7-18），并繪制藥-時(shí)曲線（見圖7-9）。對(duì)3只家兔靜注后6h體內(nèi)丹皮酚血漿濃度測定的數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)按兩室模型進(jìn)行處理，得藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)（見表7-19）。

表7-18靜注后不同時(shí)間兔血漿中丹皮酚濃度濃度（ug/ml血漿）

時(shí)間（min）No1No2No3平均233.0332.6031.2032.48518.8017.5313.9216.751016.3016.9911.9415.081512.9911.199.1511.112010.838.298.459.19309.208.027.288.17458.537.766.417.56606.706.245.756.17903.793.973.293.621203.353.232.763.111801.251.311.211.262400.900.980.970.953600.780.870.820.82

表7-19

靜脈注射丹皮酚溶液兔體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)

K12

K21

K10

T1/2（

）

T1/2（

）

VαQ

AUC

（h-1）

（h-1）

（h-1）

（h）

（min）（L）

（L/h）

（h·μg/ml）

10.59030.63820.95122.114122.4516.225.3223.1321.67810.34071.03115.779814.1953.726.4418.6330.62960.58650.81142.558123.6721.965.8520.52平均0.9660.52180.93123.484

20.1030.635.8720.76

2.討論通過殘數(shù)平方和與擬合度計(jì)算，丹皮酚靜脈注射給藥為雙室模型。分布半衰期僅20min，說明該藥進(jìn)入體內(nèi)很快分布到有關(guān)器官和組織，迅速發(fā)揮藥效。消除半衰期是3.5h左右，表明在體內(nèi)停留時(shí)間不長。從藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以看出，丹皮酚在兔體內(nèi)動(dòng)力學(xué)參數(shù)存在一定的個(gè)體差異。實(shí)例2

三維HPLC等四譜研究川芎伍用丹參煎劑對(duì)川芎嗪藥物動(dòng)力學(xué)的影響中藥復(fù)方成分復(fù)雜，特異性是其濃度測定方法的難點(diǎn)，本例選用多種先進(jìn)分析儀器，較好的地決了這一問題。對(duì)比分析圖（7-10）A、B、C所示各峰形，結(jié)合結(jié)果部分文字說明，體會(huì)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的思路。其中關(guān)于如何判斷樣品預(yù)處理去除蛋白的效果，以及關(guān)于四譜鑒定樣品來源的確認(rèn)都具有一定的啟迪作用。1.實(shí)驗(yàn)方法(略)2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1TMP和內(nèi)標(biāo)安眠酮的保留時(shí)間分別為3.992min和6.223min，見圖（7-10）?？瞻籽迳V圖為A部分；灌胃川芎煎劑后取血清經(jīng)處理色譜圖見C部分；說明樣品預(yù)處理去蛋白效果好，血清中TMP和內(nèi)標(biāo)沒有雜峰干擾（B部分）；灌胃川芎煎劑后圖中的1號(hào)蜂為TMP，與未知的6、7峰較好分離（C部分）；灌胃川丹合劑后在5與6號(hào)峰之間增加一新的峰（未列圖）。空白雙蒸水與川芎煎劑的三維色譜圖（體外）比較后表明：TMP一個(gè)峰出現(xiàn)在保留時(shí)間（Rt）為2.98min、紫外吸收波長（UV）為280nm處；另一峰出現(xiàn)在Rt2.98min、UV210nm處并與雜峰重疊。

空白血清、川芎煎劑（體外）與川芎煎劑（30g/kg）灌胃大鼠后1m1血清樣品三維色譜圖比較表明：TMP峰Rt和UV一致，但峰形較低；B峰（Rt1．8min，UV220nm，從圖上分析該處至少有2個(gè)峰，但難以分開）降低后另外出現(xiàn)一峰（Rt2.2min，UV300nm）；A與C峰則消失。2.2四譜鑒定結(jié)果：

紫外：λmaxH2O288nm；

紅外光譜：3000，1455，1420，1370，1240，1210，1195，1005，815cm-1；

核磁共振氫譜：呈現(xiàn)甲基峰δ2.45（單峰）；

質(zhì)譜：（分子離子峰136）主要碎片有m/e95（CH3C

NCCH3=CCH3），m/e54（[CH3C

CCH3]+），m/e42（[CH3C

NH]+），m/e39（[CH3C

C]+）綜合分析以上數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)報(bào)道的TMP基本符合，證明大鼠灌胃川芎煎劑后血清中所提取的1號(hào)組分即為TMP，其他組分還待進(jìn)行解析。

2.3健康Wister大鼠灌胃川芎煎劑與川丹合劑后不同時(shí)間血清藥物濃度，見表（7-20）；藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)（一級(jí)吸收速率常數(shù)（Ka），半吸收期（T1/2Ka），血藥-時(shí)曲線下面積（AUC）見表（7-21）。

表7-20川芎煎劑和川丹合劑灌胃大鼠后不同時(shí)間血清藥物含量比較（±s）

血清藥物含量（ug/ml）組別0.08h0.25h0.50h0.75h1.00h1.50h2.00h3.00h5.00h川芎煎劑0.6520.8740.5920.4750.3630.2990.2430.1480.053

s0.4870.1800.2710.2480.2620.1030.1120.0790.031川丹煎劑0.4680.5710.3920.3300.2350.1780.1660.0880.034

s0.0810.231*0.1840.1780.1250.061*0.0830.0610.013

注：兩組各6只大鼠；與川芎煎劑比較*P<0.05

表7-21健康大鼠一次川芎煎劑、川丹合劑灌胃川芎嗪藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s）

α

βKaK10

K12

K21

T1/2Ka

t1/2α

t1/2β

AUCVc/F

組別

（h-1

）

（h）

（ug·h/ml）（L/kg）

川芎煎劑

1.9280.47919.5801.0900.4700.8470.0360.3541.4481.2739.665

s

0.7190.2054.1390.5020.1600.2470.0240.1010.8800.2551.810川丹煎劑

2.3280.47911.5080.7380.2051.5110.0600.2981.4470.8367.390

s0.7190.2892.821*0.2550.0920.471**0.0200.2230.9010.168**1.089*

注：兩組各6只大鼠；與川芎煎劑比較*P<0.05，**P<0.013.討論3.1傳統(tǒng)二維HPLC法研究單體化合物時(shí)，僅以對(duì)照品與樣品色譜峰是否保留時(shí)間一致及峰形重疊來定性，是嚴(yán)謹(jǐn)，因?yàn)橐粋€(gè)峰也可能是分離不開的兩個(gè)化合物；川芎煎劑成分復(fù)雜，更造成定性錯(cuò)誤。本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列的3D-HPLC和四譜方法鑒定，更加科學(xué)和精確。3.2川芎湯劑體內(nèi)外化學(xué)成分分析：3D-HPLC測定時(shí)較2D-HPLC的測定結(jié)果多一個(gè)未知化合物，說明三維多信息檢測的優(yōu)勢，且川芎湯劑的化學(xué)成分在體內(nèi)外有所變化。在川芎煎劑給大鼠灌胃后血清樣品的三維色譜圖中少一種組分，可能是由于三氯甲烷萃取時(shí)丟失所致。所以仍需進(jìn)一步完善樣品預(yù)處理方法以更真實(shí)地反映血中川芎煎劑化學(xué)成分的變化。3.3川芎煎劑與川丹合劑比較：（1）0.25h:血藥濃度1.53倍AUC值1.52倍，說明川丹合劑生物利用度低，是丹參干擾拮抗導(dǎo)致“相惡”效應(yīng)。（2）Ka、t1/2Ka值川芎煎劑＞川丹合劑組，由于丹參伍用導(dǎo)致TMP吸收減慢。這有助于解釋臨床較少以川芎單獨(dú)伍用丹參的原因。

以上為我們提出的“復(fù)方藥物動(dòng)力學(xué)”假說提供了初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這種伍用丹參“相惡”效應(yīng)，一方面是共煎時(shí)川丹合劑中TMP與川芎煎劑相比僅81.52%溶出，即這種“相惡”發(fā)生于體外；另一方面則是由于增加丹參等于增加了多種化學(xué)成分在體內(nèi)干擾，其機(jī)制十分復(fù)雜，有待進(jìn)一步探討。三、免疫法免疫法是七十年代發(fā)展起來的新的檢測技術(shù)，用于體內(nèi)藥物的分析具有以下特點(diǎn):

取樣量小，專一性強(qiáng)，靈敏度高。常有以下兩種方法：

放射免疫法（RIA）

酶免疫法（EMIA），它們的檢測限可達(dá)0.001ng。放射免疫法

含義：一種將放射性同位素技術(shù)與免疫化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的體外測定超微量（10-9_10-10g）物質(zhì)的新技術(shù)。它兼有這兩種技術(shù)的特征：同位素技術(shù)的高靈敏度、精確性抗原抗體免疫反應(yīng)的專一性這一分析技術(shù)已發(fā)展成為一門獨(dú)立的方法學(xué)學(xué)科，在蛋白質(zhì)、多肽激素以及某些非激素、癌相關(guān)抗原等的測定方面有廣泛的應(yīng)用。

基本原理：是一種竟?fàn)幮越Y(jié)合反應(yīng)。將高度純化的待測藥物標(biāo)準(zhǔn)品作為抗原（Ag）免疫動(dòng)物，使其產(chǎn)生特異性抗體（Ab），然后將待測藥物標(biāo)準(zhǔn)品用放射性同位素（3H、131I、125I、13C等）標(biāo)記成標(biāo)記抗原（*Ag），再將*Ag、待測藥物Ag（為非標(biāo)記抗原）}混合培育，和抗體Ab使競爭性結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡。其基本反應(yīng)如下：

*Ag