第16章細(xì)胞因子及其受體檢測(cè)(免疫學(xué))

細(xì)胞因子及其受體檢測(cè)AssayforCytokineandCytokineReceptorINTRODUCTIONWhatarecytokines?KindsofcytokinesCytokine-mediatedeffectsCytokinereceptorfamiliesWhydowedetectcytokines?MethodsforcytokinesanalysisWhatarecytokines?由非神經(jīng)—內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的一大類與免疫應(yīng)答活動(dòng)密切相關(guān)的低分子蛋白與多肽。AcollectionofpolypeptidesusedforcommunicationsbetweencellsPlayrolesimilartohormones

－Hormonesusuallyactatadistance

－CytokinesactlocallyDifferfromgrowthfactorsthatareproducedconstitutively,whilecytokineproductioniscarefullyregulatedPlayanimportantroleinbothinnateandadaptiveimmunityKindsofCytokines(structureandfunction)Interleukins(IL-1….35)Colonystimulatingfactors(M-CSF、G-CSF)Interferons(a,b,g)TumornecrosisfactorsChemokines(IL-8、GROs、MCP-1)Growthfactors(EGF、FGF、IGF、PDGF)Cytokine–function(signaltransfer)CellgrowthCelldifferentiationCelldeathInducenon-responsivenesstoothercytokines/cellsInduceresponsivenesstoothercytokines/cellsInducesecretionofothercytokines1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性2、多源與同源性3、高效性4、多效性（pleiotropy）5、豐余性（redundancy）6、協(xié)同性7、拮抗性8、網(wǎng)絡(luò)性細(xì)胞因子細(xì)胞因子細(xì)胞因子受體細(xì)胞因子受體細(xì)胞因子的自分泌與旁分泌性

IL-2IFN-TNF-細(xì)胞因子的同源性與多源性IFN-

T細(xì)胞T細(xì)胞NK細(xì)胞IL-4Th細(xì)胞肥大細(xì)胞Th細(xì)胞B細(xì)胞細(xì)胞因子的多效性Th細(xì)胞B細(xì)胞細(xì)胞因子的豐余性IL-2IL-4IL-5Th細(xì)胞B細(xì)胞細(xì)胞因子的協(xié)同性IL-4IL-5Th2細(xì)胞B細(xì)胞細(xì)胞因子的拮抗性Th1細(xì)胞IL-4

IFN-

細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)性IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、GM-CSFTNFTGFIL-1IFNIL-1IFNTNFIL-1TGFIFNIL2IL-4IFNIL2IL-4IL-5IL-6TNFIFNIL-1TGFTNFIL-1IFNIL-5GM-CSFG-CSFM-GSFTNFTNFIL-1TGFIL-1IL-6GM-CSFG-CSFM-GSF

IL-1IL-6IL-1IL-6GM-CSFG-CSFM-GSFIFN內(nèi)皮細(xì)胞成纖維細(xì)胞TBWhydowedetectcytokines?DiagnosisorassistantdiagnosisMonitoringimmunefunctionCytokinetherapymonitoringStudymechanismsofdisease細(xì)胞因子檢測(cè)的特點(diǎn)免疫原性較弱樣品含量低樣品具有時(shí)效性生物效應(yīng)特異性差MethodsforcytokinesanalysisBiologicalmethodImmunologicalmehtodMolecularmethod第一節(jié)生物學(xué)檢測(cè)法根據(jù)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法。原理將細(xì)胞因子與指示系統(tǒng)如（細(xì)胞）相互作用，指示細(xì)胞發(fā)生增殖、死亡或分泌蛋白等變化來顯示細(xì)胞因子的功能。一、細(xì)胞增殖法二、靶細(xì)胞殺傷或抑制法三、細(xì)胞病變抑制法四、趨化活性測(cè)定法方法一、細(xì)胞增殖法（一）原理細(xì)胞因子可促進(jìn)相應(yīng)指示細(xì)胞分裂、增殖，如IL-2。將不同濃度的細(xì)胞因子與指示細(xì)胞共同孵育一定時(shí)間，檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，以確定細(xì)胞因子的量。（二）指示細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的刺激可產(chǎn)生增殖、死亡、分泌蛋白等生物學(xué)性狀改變的細(xì)胞直接從組織中分離，或采用體外傳代的依賴細(xì)胞株。常見指示細(xì)胞株見表16-1。（三）技術(shù)要點(diǎn)

1．

依賴細(xì)胞株的準(zhǔn)備(細(xì)胞因子解離)。2.細(xì)胞因子作用于依賴細(xì)胞株（對(duì)照）。

3．

測(cè)定細(xì)胞增殖程度。

4．細(xì)胞因子活性單位的計(jì)算。

1．3H-TdR摻入法2．

MTT比色法3.CFSE測(cè)定細(xì)胞增殖程度細(xì)胞因子的生物活性單位：指使相應(yīng)指示細(xì)胞達(dá)到最大程度增殖的50％時(shí)，所需細(xì)胞因子的含量為一個(gè)活性單位。細(xì)胞因子活性單位的計(jì)算Forexample細(xì)胞因子活性單位（U/ml)＝樣品50％最大程度增殖的稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品50％最大程度增殖的稀釋度X標(biāo)準(zhǔn)品活性單位二、靶細(xì)胞殺傷或抑制法（一）原理主要用于腫瘤壞死因子（TNF）的測(cè)定TNF具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；選擇對(duì)TNF敏感的細(xì)胞系作為靶細(xì)胞；與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。（二）TNF敏感細(xì)胞株小鼠成纖維細(xì)胞株L929和WEHI164.13（三）技術(shù)要點(diǎn)1.

靶細(xì)胞的準(zhǔn)備。2.

TNF作用于靶細(xì)胞(標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照)。3.

細(xì)胞毒反應(yīng)程度測(cè)定。4.TNF活性計(jì)算。

可直接檢測(cè)細(xì)胞的死亡情況，51Cr釋放法。檢測(cè)剩余活細(xì)胞的數(shù)量，3H-TdR摻入法、MTT比色法、結(jié)晶紫染色法。細(xì)胞毒反應(yīng)程度測(cè)定結(jié)晶紫能使活細(xì)胞染色，死細(xì)胞不著色；著色的活細(xì)胞再經(jīng)脫色，通過測(cè)定其光密度（OD值）間接推知細(xì)胞毒反應(yīng)的程度。結(jié)晶紫染色法三、細(xì)胞病變抑制法（一）原理主要用于檢測(cè)干擾素干擾素(IFN)可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，保護(hù)細(xì)胞不受病毒感染，抑制細(xì)胞病變。將指示細(xì)胞、病毒和IFN標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品置同一反應(yīng)體系中，進(jìn)行培養(yǎng)。病變程度與IFN活性成反比關(guān)系。指示細(xì)胞Wish