第七章 核酸分子雜交技術與核酸序列測定

第七章

核酸分子雜交技術與核酸序列測定

MolecularHybridization

andBlottingTechnology

主講教師：熊偉副教授/博士ContentofTable

前言1核酸分子雜交技術的原理2核酸探針的制備3核酸探針的標記4核酸分子雜交技術前言

核酸分子雜交

把親源關系較近的，不同生物個體來源的變性DNA或RNA單鏈，經(jīng)退火處理形成DNA-DNA或DNA-RNA這一過程叫分子雜交。第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理（一）核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術的原理P44復性RNADNA1.原理DNA的變性與復性2.常見條件：加熱S形曲線解鏈溫度（Tm）A260增高的原因3.分子雜交的目的

應用：(1)檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關系；(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達豐度。HomeDNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應：DNA變性時其溶液A260增高的現(xiàn)象。熱變性解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。

Tm：變性是在一個相當窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(meltingtemperature,Tm)。其大小與G+C含量成正比。

DNA的復性與分子雜交

DNA復性(renaturation)的定義在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一現(xiàn)象稱為復性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing)

。復性條件：Tm－50C4度以下幾乎不復性核酸分子雜交的應用研究DNA分子中某一種基因的位置鑒定兩種核酸分子間的序列相似性檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術的基礎第二節(jié)核酸探針技術及其標記

探針(probe)P46經(jīng)過特殊標記的核酸片段，具有特定的序列，能夠與待測的核酸片段互補結合，因此可用于檢測核酸樣品中的特定基因。一、核酸探針的種類和應用根據(jù)核酸性質和檢測目的不同可以分為：（一）基因組DNA探針（二）cDNA探針（三）RNA探針（四）人工合成的寡核苷酸探針最基本的原則是核酸探針與要檢測的核酸之間在核酸序列上要有高度的特異性基因組DNA探針真核生物基因組中存在大量的重復序列和非編碼序列，因此選擇基因組DNA做探針時，一定要充分考慮實驗目的性利用分子克隆或PCR方法可以獲得某一段特定的DNA序列cDNA探針cDNA是能與mRNA互補的DNA分子，它是利用RNA分子作模板在逆轉錄酶作用下產(chǎn)生的。利用基因克隆的方法可獲得cDNA優(yōu)點：cDNA探針不含有內(nèi)含子序列，尤其適用于基因表達的檢測。RNA探針RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應效率極高早期采用的RNA探針是細胞mRNA探針和病毒RNA探針。利用mRNA與基因的DNA雜交，可以反映出基因的轉錄狀態(tài)。

人工合成的寡核苷酸探針利用DNA合成儀，采用化學方法人工合成寡核苷酸探針設計寡核苷酸探針的原則1）序列及長度根據(jù)靶分子的序列而定，長度一般為18-50個核苷酸合適。2）堿基成分一般G+C含量為40%-60%3）探針分子內(nèi)不存在互補，避免出現(xiàn)“發(fā)夾”結構4）避免單一堿基的重復出現(xiàn)，不超過4個5）與非靶標區(qū)域的同源性不超過70%二、探針的標記探針標記方法:放射性和非放射性兩種放射性核素：32P、35S和3H

非放射性標記物：1）半抗原：生物素、地高辛素抗原-抗體反應2）配體：生物素-親和素反應3）熒光素

(FITC、羅丹明)4）化學發(fā)光探針

探針標記方法核酸分子雜交所用的探針幾乎都用體外標記法標記，分為化學法和酶法化學法P48：利用標記物分子上的活性基團與探針分子上的基團發(fā)生的化學反應直接將標記物結合到探針分子上。特點是簡單、快速、均勻。酶法P48：將標記物預先標記在核苷酸分子上，然后利用酶促反應將標記的核苷酸分子滲入到探針分子上去，或將核苷酸分子上的標記基團交換到探針分子上。一個理想的標記物應滿足：(1)標記前后探針基本結構、化學性質相同;(2)特異性強、本底低、重復性好；(3)操作簡單、節(jié)時；(4)安全、無環(huán)境污染。常用探針的標記方法3.2.1

缺口平移法3.2.2

隨機引物標記法3.2.3

末端標記法3.2.4

生物素光照標記法缺口平移法的原理

將DNAaseI的水解活性與大腸桿菌DNApolymeraseI的5`→3`的聚合酶活性和5`→3`的外切酶活性相結合。首先用E.coli的DNAseI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時利用該酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素標記的互補核苷酸補入缺口。

這兩種活性同時作用，缺口不斷向3`方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標記的核苷酸取代，成為帶有標記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標記DNA探針。

隨機引物標記法原理

用一些六核苷酸作為隨機引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補結合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補配對原則不斷在其3`-OH端添加標記的單核苷酸修補缺口，合成新的標記的探針片段。末端標記法原理（1）一種是在5`末端加成標記法：先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標記的ATP的γ-磷酸轉移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探針3`-末端用末端轉移酶摻入一個單標記的[α-32P]dNTP。生物素光照標記法

光敏生物素在紫外線照射下與DNA或RNA的堿基發(fā)生化學加成反應，獲得生物素標記的DNA探針。探針的純化

1.乙醇沉淀法用無水乙醇沉淀2-3次2.SG-50柱層析法3.微柱離心法第三節(jié)核酸分子雜交的基本方法

核酸分子雜交根據(jù)被分析樣品的性質不同，分為：液相雜交和固相雜交。固相雜交：液相中的核酸探針與位于固相支持物上的待測核酸片段進行雜交的過程。分為：原位雜交

印跡雜交印跡雜交

將通過凝膠電泳分離的核酸片段轉移到特定的固相支持物上,在轉移過程中，核酸片段保持其原來的相對位置不變，然后采用標記的核酸探針與結合于固相支持物上核酸片段進行雜交的技術。

印跡雜交類別：（一）DNA印跡技術(Southernblotting)（二）RNA印跡技術(Northernblotting)（三）蛋白質的印跡分析(Westernblotting)

二、印跡技術的類別及應用

（一）DNA印跡技術

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。從組織或細胞中提取基因組DNA→限制性內(nèi)切酶消化→瓊脂糖凝膠電泳將DNA按大小分離→含有DNA區(qū)帶的凝膠在變性溶液中變性→

DNA變性后從凝膠轉移到固相支持物上→特異性探針與固著于膜上的DNA雜交→雜交結果反映待測核酸樣品的有關基因信息。分子雜交實驗①②③白瓷盤玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉膜。真空轉膜槽濾紙尼龍膜凝膠蓋子+-真空轉膜Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉移至硝酸纖維素膜上與放射性標記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉移DNA吸附有DNA片段的膜Southern和Western印跡法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiography（二）RNA印跡技術(Northernblotting)

基本過程與Southernblotting相似。用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質的印跡分析(Westernblotting)

將待檢測蛋白質（或酶）經(jīng)