分子酶工程學(xué)概論

分子酶工程

李剛副教授教學(xué)內(nèi)容一、分子酶工程學(xué)概論；

二、定向進(jìn)化技術(shù)在微生物酶制劑研究中的應(yīng)用；

三、乳糖酶概述及其分子改造；四、漆酶概述及其分子改造；五、纖維素酶概述及其分子改造?？疾靸?nèi)容請從分子酶工程學(xué)中選一種具體的技術(shù)（比如易錯(cuò)PCR、DNAshuffling、融合酶、酶的固定化技術(shù)等），閱讀相關(guān)中英文文獻(xiàn)后，做一個(gè)ppt（中英文均可）。并在課堂上講述。要求：幻燈片數(shù)量在20張以上，圖文并茂，內(nèi)容完整而清晰。根據(jù)幻燈片的質(zhì)量和講述情況給出本門課的成績。時(shí)間：第六周開始，每次3人。每人講述20-30分鐘。一、分子酶工程學(xué)概論酶（又稱酵素，英語：Enzyme），是生物細(xì)胞原生質(zhì)合成的具有高度催化活性的蛋白質(zhì)（絕大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì)，但核酶例外），因其來源于生物體，因此通常被稱作“生物催化劑”。在酶的催化反應(yīng)體系中，反應(yīng)物分子被稱為底物，底物通過酶的催化轉(zhuǎn)化為另一種分子。幾乎所有的細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)程都需要酶的參與，以提高效率。與其他非生物催化劑相似，酶通過降低化學(xué)反應(yīng)的活化能（用Ea或ΔG?表示）來加快反應(yīng)速率，大多數(shù)的酶可以將其催化的反應(yīng)之速率提高上百萬倍；同樣，酶作為催化劑，本身在反應(yīng)過程中不被消耗，也不影響反應(yīng)的化學(xué)平衡。與其他非生物催化劑不同的是，酶具有高度的專一性，只催化特定的反應(yīng)或產(chǎn)生特定的構(gòu)型。目前已知的可以被酶催化的反應(yīng)有約4000種。

酶的特性由于酶具有催化的高效性、專一性和作用條件溫和、可調(diào)節(jié)性等優(yōu)點(diǎn)，所以越來越得到重視，被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，在提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低成本、節(jié)約原料和能源、保護(hù)環(huán)境等方面產(chǎn)生了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。酶制劑從生物(包括動(dòng)物、植物、微生物)中提取的具有生物催化能力的物質(zhì)（酶），輔以其他成分（添加劑、穩(wěn)定劑等，可以為固體，也可以為液體），所組成的用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的含有酶的混合物，稱為酶制劑。

酶工程（EnzymeEngineering）

從應(yīng)用目的出發(fā)研究酶，在一定的生物反應(yīng)裝置中利用酶的催化性質(zhì)，將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用的物質(zhì)。是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合形成的一門新的技術(shù)科學(xué)，是酶學(xué)、微生物學(xué)的基本原理與化學(xué)工程有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的邊緣科學(xué)。酶工程的分類（一）化學(xué)酶工程：也稱為初級(jí)酶工程，它主要由酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)相互結(jié)合而形成。（二）生物酶工程：也稱為高級(jí)酶工程。是在化學(xué)酶工程基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是以酶學(xué)和DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。目前，生物酶工程的一個(gè)重要組成部分為分子酶工程學(xué)。

分子酶工程學(xué)

（molecularenzymeEngineering）分子酶工程學(xué)就是采用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法和技術(shù),研究酶基因的克隆和表達(dá)、酶蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及對酶進(jìn)行再設(shè)計(jì)和定向加工,以發(fā)展更優(yōu)良的新酶或新功能酶。(一）化學(xué)酶工程1.自然酶制劑的開發(fā)與應(yīng)用；2.酶的化學(xué)修飾；3.酶的固定化；4.人工合成酶的研制和模擬酶。自然酶的開發(fā)與應(yīng)用具估計(jì)自然界中存在的酶有7000種左右，其中經(jīng)過鑒定和分類的有2000多種，但大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的商品酶只有數(shù)十種，小批量生產(chǎn)的商品酶約數(shù)百種。自然酶開發(fā)的一個(gè)新的方向是從極端環(huán)境微生物（extremophiles）和不可培養(yǎng)的微生物（unculturablemicroorganisms）中開發(fā)新酶。所謂不可培養(yǎng)的微生物是指在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)不出的微生物，而這類微生物約占全部微生物的99%?；瘜W(xué)酶工程中自然酶的獲得主要采用化學(xué)方法從天然材料中提取和純化。天然酶在生物體中含量一般較低，難以提取和大量制備，因而限制了它的推廣應(yīng)用。自然酶的應(yīng)用領(lǐng)域1、食品工業(yè)中的應(yīng)用：如淀粉加工、乳品加工、果汁加工、食品烘烤及啤酒發(fā)酵。相關(guān)的酶如淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、乳糖酶等占酶制劑市場的一半以上。2、輕化工業(yè)中的應(yīng)用：如洗滌劑制造、毛皮工業(yè)、明膠制、膠原纖維制造、牙膏和化妝品的生產(chǎn)、廢水廢物處理和飼料加工等。3、能源開發(fā)上的應(yīng)用：如利用植物、農(nóng)作物、林業(yè)產(chǎn)物廢物中的纖維素及半纖維素等原料制造甲烷等氣體染料以及乙醇和甲醇等液體燃料。4、環(huán)境工程上的應(yīng)用：利用微生物中酶的作用，可將廢水中的有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成可利用的小分子物質(zhì)，同時(shí)達(dá)到凈化廢水的目的。5、醫(yī)藥行業(yè)上的應(yīng)用：藥用酶、抗體酶和酶標(biāo)藥物的研究開發(fā)及新型的溶栓酶、艾滋病毒蛋白酶等的研究。另外，與細(xì)胞的壽命和癌變有密切關(guān)系的端粒酶的催化機(jī)制的研究已經(jīng)成為自然酶的研究熱點(diǎn)之一。酶的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾是指利用化學(xué)手段將某些化學(xué)物質(zhì)或基團(tuán)結(jié)合到酶分子上，或?qū)⒚阜肿拥哪巢糠秩コ蛑脫Q，改變酶的理化性質(zhì)，最終達(dá)到改變酶的催化性能的目的。酶的化學(xué)修飾主要有以下幾種方法：（1）修飾酶的功能基團(tuán)，如氨基、羥基等；（2）酶分子內(nèi)或分子間交聯(lián)；（3）酶與高分子化合物結(jié)合，以增加酶的穩(wěn)定性。酶的固定化固定化酶是指被結(jié)合到特定的支持物上并能發(fā)揮作用的一類酶，是化學(xué)酶工程中具有強(qiáng)大生命力的主干和熱點(diǎn)。酶的固定化技術(shù)包括吸附、交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合及包埋4種方法。固定化酶在工業(yè)、臨床、分析和環(huán)境保護(hù)等方面有著廣泛的應(yīng)用。最近，有序的、定向固定化技術(shù)成為酶的固定化技術(shù)中的熱點(diǎn)，已經(jīng)用于生物芯片、生物傳感器、生物反應(yīng)器等的研究中。人工合成酶的研制和模擬酶人們將人工合成的具有類似酶活性的高聚物成為人工合成酶（synzymes）。人工合成酶在結(jié)構(gòu)上必須具有2個(gè)特殊部位，即一個(gè)是底物結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是催化位點(diǎn)。模擬酶方面，研究的熱點(diǎn)主要是對固氮酶的模擬。天然固氮酶由鐵蛋白和鐵鉬蛋白2種組分組成，人們從組成分析出發(fā)提出了多種固氮酶模型，由此進(jìn)一步利用鐵、銅、鈷等過渡金屬絡(luò)合物模擬過氧化氫酶等。（二）生物酶工程1.酶基因的克隆和表達(dá)；2.酶的遺傳修飾；3.酶的遺傳設(shè)計(jì)。酶基因的克隆和表達(dá)即利用基因工程技術(shù)（如PCR技術(shù)、雜交技術(shù)）克隆和表達(dá)各種天然的酶蛋白基因。目前已有組織纖溶酶原激活劑（TPA）與凝乳酶等100多種酶基因已經(jīng)克隆成功，有些還得到了高效的異源表達(dá)。酶的遺傳修飾酶的遺傳修飾即采用定點(diǎn)突變和體外分子定向進(jìn)化2種方式對天然酶分子進(jìn)行改造。定點(diǎn)突變需要知道酶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)及編碼序列，并根據(jù)但比之空間結(jié)構(gòu)知識(shí)來設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)。體外分子定向進(jìn)化是近幾年新興的一種蛋白質(zhì)改造策略，可以在尚不知道蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)或者根據(jù)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)知識(shí)尚不能進(jìn)行有效的定點(diǎn)突變時(shí)，借鑒實(shí)驗(yàn)室手段在體外模擬自然進(jìn)化的過程（隨機(jī)突變、重組和選擇），使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需性質(zhì)或功能，從而使幾百萬年的自然進(jìn)化過程在短期內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)。酶的遺傳設(shè)計(jì)酶的遺傳設(shè)計(jì)的主要目的是創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)酶，用于生產(chǎn)昂貴特殊的藥品和超自然的生物制品，以滿足人類的特殊需要。酶的遺傳設(shè)計(jì)的關(guān)鍵技術(shù)是根據(jù)酶的氨基酸序列預(yù)言其空間結(jié)構(gòu)，并解決酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和化學(xué)理論的發(fā)展，酶或其他大分子的模擬在精確度、速度及規(guī)模上都會(huì)得到改善。酶的分類1．氧化還原酶2．轉(zhuǎn)移酶3．水解酶4．裂合酶5．異構(gòu)酶6．連接酶（合成酶）7．核酸酶（催化核酸）1．氧化還原酶(Oxidoreductase)包括脫氫酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、過氧化物酶、氧合酶、細(xì)胞色素氧化酶等。2．轉(zhuǎn)移酶(Transferase)包括酮醛基轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶、糖苷基轉(zhuǎn)移酶、含氮基轉(zhuǎn)移酶等。3．水解酶(Hydrolase)脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需輔酶。4．裂合酶(Lyase)這類酶可脫去底物上某一基團(tuán)留下雙鍵，或可相反地在雙鍵處加入某一基團(tuán)。5．異構(gòu)酶(Isomerase)此類酶為生物代謝需要對某些物質(zhì)進(jìn)行分子異構(gòu)化，分別進(jìn)行外消旋、差向異構(gòu)、順反異構(gòu)等6．連接酶（合成酶）(LigaseorSynthetase)這類酶關(guān)系很多生命物質(zhì)的合成，其特點(diǎn)是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作為結(jié)合能源，有的還需金屬離子輔助因子。分別形成C-O鍵（與蛋白質(zhì)合成有關(guān)）、C-S鍵（與脂肪酸合成有關(guān)）、C-C鍵和磷酸酯鍵。

7.核酸酶（催化核酸）Ribozyme核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一類特殊的RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應(yīng)。酶用于生物催化的概況類別占總酶比例%利用率%水解酶hydrolases2665氧化還原酶oxidoreductases2725轉(zhuǎn)移酶transferases245裂合酶lyases12~5異構(gòu)酶isomerases5~1連接酶ligases6~1底物生物反應(yīng)器檢測控制儀表培養(yǎng)基（滅菌）經(jīng)加工原料酶細(xì)胞生物催化劑（游離或固定化）機(jī)械能除菌空氣產(chǎn)品提取純化副產(chǎn)品產(chǎn)品廢物熱能原材料營養(yǎng)物典型工業(yè)生物技術(shù)過程核心技術(shù)？生物催化（Biocatalysis)

利用酶或有機(jī)體（細(xì)胞或細(xì)胞器等）作為催化劑實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程。生物轉(zhuǎn)化（Biotransformation)污染物經(jīng)生物體或其酶的作用而發(fā)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或價(jià)態(tài)變化的過程。如藥物或毒物在體內(nèi)的代謝過程，有毒物質(zhì)在土壤內(nèi)的分解過程等。

生物催化化學(xué)工業(yè)發(fā)酵工業(yè)輕工業(yè)采礦醫(yī)藥食品能源材料生物安全環(huán)境生物催化是工業(yè)生物技術(shù)的核心技術(shù)以生物催化法合成的主要產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱產(chǎn)量丙烯酰胺10萬噸/年聚乳酸1.3萬噸/年阿斯巴甜2萬噸/年生物柴油與汽油1000萬噸/年抗菌素中間體6－APA0.9萬噸/年

生物催化發(fā)展的主要推動(dòng)力新產(chǎn)品需求(社會(huì)壓力)-健康：醫(yī)藥、檢測-日用品：洗滌用品、乳品、生物可降解塑料環(huán)境(法律法規(guī)壓力)－綠色化學(xué)、能源、溫室效應(yīng)新發(fā)現(xiàn)或基礎(chǔ)研究(技術(shù)壓力）－基因工程/定點(diǎn)突變/定向進(jìn)化、代謝工程、組合化學(xué)

得益/成本降低(商業(yè)壓力)-生物分離TheBiocatalysisCycle生物催化劑工程的目標(biāo)

開發(fā)生物催化劑：催化性能更好、更快，成本更低，催化反應(yīng)更廣泛，功能更多樣。改善性能:穩(wěn)定性,活性，溶劑兼容性。開發(fā)分子模型:新酶的快速重新設(shè)計(jì)。創(chuàng)造新技術(shù):用于新生物催化劑的開發(fā)。

生物催化劑發(fā)展的工業(yè)展望CompetitiveImperativeCurrentChemicalVarietiesCurrentBiocatalystsBiocatalystoftheFutureSpeedtoMarket2-5years10years2-3yearsCosttoManufacture$1-10/kg$10-100/kg$1-3/kgRangeofProductsBroadNarrowBroad生物催化劑工程技術(shù)瓶頸對生物催化劑作用機(jī)理缺乏深入的認(rèn)識(shí)；對次級(jí)代謝產(chǎn)物代謝途徑（包括途徑間相互關(guān)系）缺乏理解；細(xì)胞工程化的方法十分有限（即代謝工程）；生產(chǎn)酶和輔因子的成本過高。當(dāng)前生物催化的研究熱點(diǎn)新酶或已有酶的新功能的開發(fā)根據(jù)已有底物開發(fā)新的酶反應(yīng)利用突變或定向進(jìn)化技術(shù)改善生物催化劑性能利用重組DNA技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)生物催化劑利用有機(jī)溶劑或共溶劑開發(fā)新的反應(yīng)體系體內(nèi)或體外合成的多酶體系克服底物和產(chǎn)物抑制精細(xì)化工品或醫(yī)藥合成技術(shù)的放大輔因子再生生物催化劑的修飾生物催化劑的固定化生物催化劑的發(fā)現(xiàn)微生物可培養(yǎng)微生物酶資源的開發(fā)利用不可培養(yǎng)微生物酶資源的開發(fā)利用（宏基因組技術(shù)metagenomics）基因已知基因的克隆未知基因的克隆酶學(xué)研究簡史1878德國的Kuhne定義Enzyme原意為在酵母中1926美國的Sumner從刀豆中得到脲酶結(jié)晶（1947年諾貝爾獎(jiǎng)）1970美國的Smith發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶（1979年諾貝爾獎(jiǎng)）1969日本固定化氨基?；?，第一次將固定化酶成功地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)?！腹こ陶Q生1986美國核酶發(fā)現(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)國內(nèi)外酶制劑工業(yè)概況1．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀；2．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用差異；3．我國酶制劑工業(yè)的若干對策建議。1.國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀世界三大酶制劑公司：（1）NovoNordisk（丹麥，后來其酶制劑部門獨(dú)立出來，成立了一個(gè)專門的酶制劑公司Novozymes，諾維信）（2）GenencorInternational(美國，杰能科）（3）Cuitor(芬蘭）三大公司銷售額占世界總額的70%。國際市場酶制劑銷售額比例

2001年工業(yè)酶制劑的世界市場約為15億美元,2008年預(yù)計(jì)約為30億美元。用于制藥工業(yè)與精細(xì)化學(xué)工業(yè)約1.2億~1.5億美元2.我國酶工業(yè)發(fā)展階段（1）1965無錫酶制劑廠淀粉酶（2）1979糖化酶（3）堿性蛋白酶（4）中性蛋白酶（5）1993耐高溫淀粉酶（6）1998國外大公司紛紛入駐1999年投產(chǎn)我國的酶制劑工業(yè)，自1965年在無錫建立我國第一個(gè)酶制劑廠以來，經(jīng)過三十多年努力，已形成了一定生產(chǎn)規(guī)模。我國酶生產(chǎn)產(chǎn)品與品種

有α-淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶、β-葡聚糖酶等15個(gè)產(chǎn)品，50～60個(gè)品種。我國酶工業(yè)生產(chǎn)水平酶制劑生產(chǎn)水平成倍或十多倍的提高，特別是糖化酶生產(chǎn)水平提高15倍，達(dá)到國際水平。

產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定提高：特別是糖化酶產(chǎn)品質(zhì)量已達(dá)到國際先進(jìn)水平，在國際市場上有較高競爭能力。國內(nèi)酶制劑銷售額比例國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用差異1．規(guī)模：國外多公司重組；國內(nèi)重復(fù)建設(shè)、效益低；2投入：國外：開發(fā)經(jīng)費(fèi)占銷售額的15%，甚至19%；國內(nèi)：研究、開發(fā)投入不足，占1%銷售額；3開發(fā)重點(diǎn)：國外：大力研制、開發(fā)新酶種和新用途；國內(nèi)：品種少、劑型少。3．我國酶制劑工業(yè)的若干對策、建議

酶制劑工業(yè)是21世紀(jì)最有希望的新興產(chǎn)業(yè)之一，為了適應(yīng)這個(gè)發(fā)展趨勢，我國酶制劑工業(yè)以后5-8年的發(fā)展，主要考慮在現(xiàn)有應(yīng)用領(lǐng)域提高基礎(chǔ)上，重點(diǎn)發(fā)展的應(yīng)用領(lǐng)域是：動(dòng)物飼料工業(yè)、低聚糖工業(yè)、棉纖維與紡織加工、洗滌劑、焙烤工業(yè)、防護(hù)用品、蛋白質(zhì)水解、淀粉改良、紙漿、造紙用酶等。只有這樣，才能趕上國際酶制劑發(fā)展步伐。加快調(diào)整產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，努力提