木葡糖酸醋桿菌趨化性反應(yīng)的毛細(xì)管法研究

木葡糖酸醋桿菌趨化性反應(yīng)的毛細(xì)管法研究

木葡萄糖醋菌是研究中最透明的細(xì)菌素類公司。其生產(chǎn)的細(xì)菌素可廣泛應(yīng)用于食品、造紙、醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域。細(xì)菌的誘導(dǎo)是對(duì)具有運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)菌對(duì)化學(xué)濃度的反應(yīng)，并將細(xì)菌引導(dǎo)到有害物質(zhì)中以避免疾病刺激。細(xì)菌的誘導(dǎo)對(duì)微生物的動(dòng)力性有重要影響，表明細(xì)菌在化學(xué)上具有顯著的生長優(yōu)勢。因此，細(xì)菌的誘導(dǎo)對(duì)于植物疾病的發(fā)病機(jī)制和生物膜的形成具有重要意義。關(guān)于細(xì)菌的誘導(dǎo)有很多方法。除了近年來開發(fā)的線性濃度梯度微通道裝置可以精確地定量分析細(xì)菌的誘導(dǎo)反應(yīng)外，最常用的方法是游泳板法和毛細(xì)管法?，F(xiàn)在對(duì)趨勢的研究非常深入，關(guān)于moin-a族多樣性的研究很少。因此，在這項(xiàng)工作中，我們使用毛細(xì)管法研究了不同培養(yǎng)參數(shù)對(duì)木葡萄糖酸醋群落趨勢的影響。1材料和方法1.1材料表面1.1.1tobacterxylixylingcno.1.1.1木葡糖酸醋桿菌(GluconacetobacterxylinusCGMCCNo.1.1812),工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏.1.1.2培養(yǎng)基和試劑液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖25,酵母粉7.5,蛋白胨10,Na2,HPO410,pH6.0.固體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖25,酵母粉7.5,蛋白胨10,Na2,HPO410,瓊脂20.無機(jī)培養(yǎng)基(g/L):Na2,HPO43,KH2,PO41,(NH4)2,SO45,MgCl20.02,CaCl20.02,對(duì)氨基苯甲酸0.001,5,pH,6.0.1.2方法1.2.1a磷酸鹽緩沖劑a取甘油管中保存的菌液接入裝有100,mL液體培養(yǎng)基的500,mL搖瓶中,30,℃、160,r/min振蕩培養(yǎng)24,h,加入1,mL纖維素酶(10,000,U/mL)酶解后5,000,r/min離心10,min得到沉淀的菌體,用趨化緩沖液(0.01,mol/L磷酸氫鉀鹽緩沖液含0.1,mol/LEDTA)洗3次,調(diào)至A600為0.1左右.1.2.2金屬離子趨化劑溶液配制0.1,g/L葡萄糖溶液,用0.22,μm濾膜過濾除菌,最后加到無機(jī)培養(yǎng)基的終濃度為1,mmol/L.其他碳源、氨基酸、酸和金屬離子趨化待測液的配制同葡萄糖趨化待測液,終濃度皆為1,mmol/L.1.2.3木葡糖酸醋桿菌趨化性反應(yīng)的測定采用改進(jìn)的毛細(xì)管法進(jìn)行趨化性反應(yīng)實(shí)驗(yàn).玻璃毛細(xì)管(內(nèi)徑為0.3,mm)一端吸入趨化待測液,另一端蠟融封閉,將毛細(xì)管插入到含300,μL菌液的1,mL注射器中.30,℃下水平孵育60,min.用滅菌水沖毛細(xì)管外壁以去除附著的菌液,折斷毛細(xì)管后將內(nèi)含物吹入EP管中,加入1,mL無菌水稀釋100倍后取100,μL菌液涂布固體平板.平板于30,℃下培養(yǎng)4,d,統(tǒng)計(jì)單菌落個(gè)數(shù).以毛細(xì)管中細(xì)菌數(shù)來衡量木葡糖酸醋桿菌趨化性反應(yīng)的大小.1.2.4ph對(duì)木葡萄糖酸醋群落化的影響配制不同pH趨化緩沖液,加入終濃度為1,mmol/L葡萄糖趨化待測液,按1.2.3的方法進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn).1.2.5溫度對(duì)木葡糖酸醋菌的形成的影響在不同溫度下按1.2.3的方法進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn).1.2.6強(qiáng)化時(shí)間對(duì)木葡萄糖酸醋群落的強(qiáng)化影響按1.2.3的方法測定不同趨化時(shí)間的菌體趨化結(jié)果.1.2.7數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin8.0和SPSS13.0軟件進(jìn)行分析.2結(jié)果與討論2.1ph對(duì)木葡糖酸醋桿菌生長的影響pH對(duì)木葡糖酸醋桿菌趨化性的影響如圖1所示.當(dāng)pH為5時(shí)木葡糖酸醋桿菌在毛細(xì)管中的細(xì)菌數(shù)高于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.05).Hwang等研究發(fā)現(xiàn)木葡糖酸醋桿菌在pH5.5最適合細(xì)菌增長和細(xì)菌纖維素合成.馬霞的實(shí)驗(yàn)結(jié)論證明,木葡糖酸醋桿菌生長的最適pH范圍為4.0~6.0.這表明不同pH對(duì)木葡糖酸醋桿菌趨化性的影響與對(duì)生長的影響一致.2.2木葡糖酸醋桿菌生長溫度的影響溫度對(duì)木葡糖酸醋桿菌趨化性的影響如圖2所示.在溫度為25,℃時(shí)毛細(xì)管中細(xì)菌數(shù)顯著高于15,℃和20,℃實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),與30,℃實(shí)驗(yàn)組相比無顯著性差異.Adler研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在15,℃或以下無趨化性,說明溫度對(duì)細(xì)菌趨化性有影響.Larsen等認(rèn)為溫度對(duì)趨化的影響可能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和受體的磷酸化和甲基化相關(guān),它們都隨溫度升高而增強(qiáng),因?yàn)榱姿峄图谆^程需要有酶參與,而酶的活性與溫度有關(guān).木葡糖酸醋桿菌的最適生長溫度為30,℃,結(jié)果表明趨化最適溫度與其生長的最適溫度有一定偶聯(lián)關(guān)系.2.3木葡糖酸醋桿菌趨化時(shí)間的確定趨化時(shí)間對(duì)木葡糖酸醋桿菌趨化性的影響如圖3所示.隨時(shí)間的延長,毛細(xì)管中細(xì)菌數(shù)不斷增加,在60,min時(shí)顯著高于30,min和45,min實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),與75,min實(shí)驗(yàn)組無顯著性差異,顯示當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長不會(huì)提高趨化性反應(yīng).Berg等在大腸桿菌毛細(xì)管趨化性實(shí)驗(yàn)中也選擇60,min為趨化時(shí)間.趨化時(shí)間再延長而趨化細(xì)菌數(shù)并不增加,可能因?yàn)榧?xì)菌的趨化運(yùn)動(dòng)在60,min達(dá)到飽和,還可能因?yàn)槟酒咸撬岽讞U菌產(chǎn)生的纖維素絲相互交織從而阻礙了菌體的運(yùn)動(dòng).2.4氨基酸對(duì)木葡糖酸醋桿菌生長的影響氨基酸對(duì)木葡糖酸醋桿菌趨化性的影響如圖4所示.L–亮氨酸(Leu)、L–丙氨酸(Ala)、L–甘氨酸(Gly)、L–甲硫氨酸(Met)實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)管中細(xì)菌數(shù)顯著多于對(duì)照組(P<0.05).L–天門冬氨酸(Asp)、L–色氨酸(Thr)、L–蘇氨酸(Trp),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無顯著性差異.氨基酸作為有機(jī)氮源可促進(jìn)木葡糖酸醋桿菌的生長.Matsuoka等研究發(fā)現(xiàn),甲硫氨酸可以顯著促進(jìn)木葡糖酸醋桿菌生長,而本文的研究中發(fā)現(xiàn),L–甲硫氨酸對(duì)趨化的促進(jìn)作用也最大.2.5木葡糖酸醋桿菌趨化性反應(yīng)酸對(duì)木葡糖酸醋桿菌趨化性的影響如圖5所示.檸檬酸實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)管中細(xì)菌數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05).馬霞等研究發(fā)現(xiàn)乙酸和檸檬酸均對(duì)木葡糖酸醋桿菌的生長有促進(jìn)作用,因有機(jī)酸可參與到代謝途徑為菌體提供能量.Alexandre等研究了巴西固氮螺菌的趨化性,發(fā)現(xiàn)代謝物如蘋果酸等有增強(qiáng)巴西固氮螺菌趨化性的作用,這種代謝物增強(qiáng)細(xì)菌趨化性的反應(yīng)稱為能量依賴型趨化性反應(yīng).檸檬酸和乙酸是木葡糖酸醋桿菌的代謝物,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這兩種代謝物未增強(qiáng)木葡糖酸醋桿菌的趨化性反應(yīng),因此木葡糖酸醋桿菌的趨化性反應(yīng)類型可能屬于非能量依賴型趨化性反應(yīng).2.6蔗糖和蔗糖對(duì)木葡糖酸醋桿菌趨化性的影響圖6所示碳源對(duì)木葡糖酸醋桿菌趨化性的影響.葡萄糖實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)管中細(xì)菌數(shù)顯著多于對(duì)照組,其余各組顯著低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05).Gaworzewska等研究葡萄糖和蔗糖對(duì)豆科根瘤菌趨化性的影響分別是促進(jìn)作用和抑制作用,這與對(duì)木葡糖酸醋桿菌的趨化作用影響相同.而對(duì)碳源影響趨化性可能由于其參與代謝,會(huì)對(duì)趨化信號(hào)分子的傳導(dǎo)產(chǎn)生影響.2.7細(xì)菌趨化性試驗(yàn)金屬離子對(duì)木葡糖酸醋桿菌趨化性的影響如圖7所示,Sn2+、Mn2+、Pb2+、Cr2+、Co2+離子實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)管中細(xì)菌數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05).細(xì)菌的趨化性不僅可以使細(xì)菌趨向有益物質(zhì),獲得更多的碳源、能源等,還可以使其逃避有害物質(zhì),如重金屬離子的毒害作用.Tso等證明大腸桿菌可以對(duì)許多化合物產(chǎn)生負(fù)趨化,其中包括金屬離子.木葡糖酸醋桿菌受體蛋白的種類和作用還需要進(jìn)一步研究.3木葡糖酸醋桿菌趨化性反應(yīng)木葡糖酸醋桿菌在溫度25~30,℃、pH5、趨化時(shí)間60,mi