基于代謝組學(xué)的黃連治療型糖尿病的機(jī)制研究

基于代謝組學(xué)的黃連治療型糖尿病的機(jī)制研究

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，主要表現(xiàn)為糖酶，伴有糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝障礙。Ⅱ型糖尿病的發(fā)生是多源性的,是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,病因與胰島素抵抗和胰島素分泌不足有關(guān)。目前關(guān)于糖尿病的治療有很多種方法,包括合理控制飲食、適量的運(yùn)動(dòng)、藥物治療等。其中,降糖的藥物主要分為中藥和西藥,中藥雖然降糖速度、降糖效果不及西藥,但中藥在預(yù)防糖尿病合并癥的發(fā)生、發(fā)展方面有一定的優(yōu)勢,所以,關(guān)于中藥治療糖尿病的機(jī)制日益被關(guān)注和重視。代謝組學(xué)是繼蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)后發(fā)展的一種全新的組學(xué)技術(shù),它利用高分離效率、高靈敏度的儀器,研究生物體對病理生理刺激或基因修飾產(chǎn)生的代謝物質(zhì)的質(zhì)和量的動(dòng)態(tài)變化,揭示生物體的病理生理變化實(shí)質(zhì)和機(jī)制。與藥理生化指標(biāo)相比較,代謝組學(xué)能夠提供更豐富的機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)的信息,所以,該方法在藥物代謝、藥物毒性篩選和作用機(jī)制研究中有很好的前途。黃連為毛莨科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdletoideaC.ChengetetHsiao)和云南黃連(Coptis.teetaWall)的根,味苦、性寒,入心、肝、胃、大腸經(jīng),可清熱燥濕,瀉火解毒。具有抗炎、抗菌、抗?jié)儭⒃黾庸跔顒?dòng)脈血流量和降低血壓的作用,目前亦被應(yīng)用于糖尿病的臨床治療,能明顯改善糖尿病“三多一少”的癥狀。小檗堿是黃連的主要活性成分,近年來已被應(yīng)用于糖尿病的長期臨床治療。前期研究結(jié)果表明,小檗堿具有降血糖、提高胰島素敏感性、調(diào)節(jié)脂肪代謝紊亂的作用。但是從機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)的角度分析黃連治療糖尿病的機(jī)理還缺少相關(guān)研究。代謝組學(xué)的出現(xiàn)為中藥從機(jī)體分子層次研究治療疾病的機(jī)理提供了可行性的實(shí)驗(yàn)方法。本文應(yīng)用代謝組學(xué)的方法,研究黃連對Ⅱ型糖尿病機(jī)體中內(nèi)源性物質(zhì)的影響,從內(nèi)源性物質(zhì)在黃連給藥前后的變化趨勢來探討黃連治療Ⅱ型糖尿病的可能代謝途徑,進(jìn)而為中藥治療糖尿病機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)參考。1實(shí)驗(yàn)部分1.1藥物、藥物和藥物日本島津QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS-QP2010),配備電子轟擊(EI)離子源,AOC-20i自動(dòng)進(jìn)樣器,CENCO型渦旋儀(荷蘭Breda公司),BiofugeStratos型低溫高速離心機(jī)(德國Heracus公司),Labconco型冷凍干燥機(jī)(美國Labconco公司)。N,O-雙三甲硅基三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、脲酶和吡啶(分析純,美國Sigma-Aldrich公司),鏈脲佐菌素(STZ)購自北京博愛港商貿(mào)有限公司。二甲雙胍購自天津太平洋藥業(yè)有限公司。黃連藥材購自大連陽光藥房。羥基乙酸(glycolate)、4-甲基苯酚(4-methylphenol)、苯甲酸(benzoicacid)、1H-吲哚(1H-indole)、2,3-二羥基丁酸(2,3-dihydroxy-butanoicacid)、蘋果酸(malicacid)、丁四醇(threitol)、3-羥基己二酸(3-hydroxyhexanedioicacid)、阿拉伯糖醇(arabinitol)、L-抗壞血酸(L-ascorbicacid)、氨基丙二酸(aminomalonicacid)、核糖酸(ribonicacid)標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物癸酸均購自美國Sigma-Aldrich公司。1.2制備含生藥溶液取黃連適量,加相當(dāng)于藥材10倍體積的冷水浸泡0.5h,加熱至沸騰,煎煮2h,傾出藥液,殘?jiān)尤?倍體積的水,煎煮2h后取藥液,合并2次藥液,過濾,減壓濃縮至相當(dāng)于1mL含生藥1g,置于4℃冰箱中備用。1.3大鼠的造模造藥雄性Wistar大鼠(160~180g)購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,每日給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)食物和飲用水各兩次,保持光照和避光循環(huán)飼養(yǎng)(12h/12h);實(shí)驗(yàn)開始前保持室內(nèi)飼養(yǎng)1周。1周后,大鼠每日灌胃脂肪乳1mL/100g,連續(xù)灌胃20d。脂肪乳的配方是20g豬油、0.5g甲基硫氧嘧啶、5g膽固醇、1g谷氨酸鈉、5g蔗糖、5g果糖、20mL吐溫-80和10mL甘油混勻,用水定容到100mL。灌胃脂肪乳20d后,大鼠禁食12h,腹腔注射STZ40mg/kg,注射后72h,用UltraTM穩(wěn)豪型血糖儀(美國強(qiáng)生公司)測大鼠的空腹血糖(FBG),血糖值大于11.0mmol/L的大鼠為糖尿病大鼠,納入實(shí)驗(yàn)。糖尿病大鼠分為模型組、黃連組(給藥量10g/kg黃連提取物)和二甲雙胍組(給藥量0.08g/kg),均采用口服灌胃給藥方式,給藥30d,同時(shí)大鼠每日上午給藥(模型組大鼠灌胃等量生理鹽水),下午灌胃脂肪乳1mL/100g;正常組每日上下午各一次,均灌胃給予等量的生理鹽水。1.4-80坡大鼠給藥30d后,從最后一次給藥開始,代謝24h,24h后大鼠放入代謝籠中,正常飲食和飲水,收集24h尿液,置于-80℃冰箱中備用。收集24h尿液后,大鼠禁食12h,乙醚淺麻醉后,眼眶采血于肝素鈉管,離心后,血漿用于檢測膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科檢驗(yàn)),同時(shí)剪尾采血測FBG,然后灌胃葡萄糖溶液2g/kg,做口服糖耐量試驗(yàn),分別測灌胃后30、60、120min時(shí)的血糖值(BG)。1.5去尿器h的去尿工藝尿樣于室溫下解凍后于5000r/min離心5min,移取上清液100μL于1.5mL離心管中,加入50μL脲酶水溶液(60IU/100μL),混合均勻后于37℃水浴孵育0.5h以去除尿液中含有的尿素。孵育結(jié)束后加入20μL內(nèi)標(biāo)(0.088g/L癸酸溶液)及400μL甲醇,渦旋1min混勻,于12000r/min4℃離心15min,吸取上清液400μL于進(jìn)樣瓶中,加入50μL衍生化試劑(V(BSTFA)∶V(TMCS)=99∶1)和50μL吡啶,于80℃水浴反應(yīng)0.5h,離心,上清液用于GC-MS分析。質(zhì)控(QC)尿樣的制備:所有尿樣于室溫下解凍,每個(gè)尿樣吸取50μL于同一5mL離心管中,渦旋1min混合均勻,按照上述尿樣制備方法制備QC尿樣,用于GC-MS分析。在分析序列中,每8個(gè)樣本加入一個(gè)QC樣本。1.6流速和流比HP-5色譜柱:30m×0.32mm×0.25μm(AgilentJ﹠W);進(jìn)樣口溫度:280℃;分流比:10∶1;載氣He;流速:1.88mL/min;柱溫程序:起始溫度60℃,保持3min后,以4℃/min的速度升溫,升溫到270℃,在270℃保持10min。進(jìn)樣量:1.0μL。離子源和接口溫度分別為200℃和300℃;電子能量:70eV;溶劑延遲:5.5min;全掃描模式,掃描范圍m/z40~600。1.7分析峰表及主成分分析藥理數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件中one-wayANOVA進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩兩比較用t檢驗(yàn)方法,結(jié)果以p<0.05表示有顯著性差異。尿樣原始數(shù)據(jù)采用GC-MS工作軟件積分,積分后導(dǎo)出數(shù)據(jù),經(jīng)自編軟件進(jìn)行峰匹配,設(shè)定峰匹配時(shí)間半徑為0.05min,峰寬為0.5min,峰匹配后得到原始峰表。在原始峰表中去除QC樣本測定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)大于15%的變量及空白實(shí)驗(yàn)中存在的變量,獲得最終的分析峰表。主成分分析(PCA)采用SIMCA-P軟件(version11.0,UmetricsAB,Sweden)進(jìn)行。t檢驗(yàn)同樣采用SPSS13.0軟件。2結(jié)果與討論2.1對大鼠模型的影響大鼠治療前后空腹血糖值的結(jié)果見表1,在大鼠給藥前,模型組、黃連組、二甲雙胍組的空腹血糖值與正常組比較顯著性上升(三者沒有顯著性差異),均為Ⅱ型糖尿病模型大鼠(FBG>11.0mmol/L)。模型組大鼠的空腹血糖值在大鼠給藥前后(生理鹽水30d)沒有顯著性差異,說明該造模方法獲得的Ⅱ型糖尿病模型是穩(wěn)定的。糖尿病大鼠給藥黃連30d后,大鼠的空腹血糖值與模型組相比降低了59.26%。黃連給藥后,大鼠的空腹血糖值與給藥前相比較降低了53.42%。二甲雙胍給藥后,大鼠的空腹血糖值與給藥前相比較降低了41.65%。結(jié)果說明黃連、二甲雙胍均有降低血糖的作用。對各組糖尿病大鼠口服糖耐量試驗(yàn)的結(jié)果見圖1,大鼠灌胃葡萄糖溶液30,60min后,與模型組比較,各給藥組的血糖值有降低的趨勢,但無顯著性改變。大鼠灌胃葡萄糖溶液120min后,與模型組比較,黃連組、二甲雙胍組的血糖值顯著性降低。黃連組、二甲雙胍組血糖曲線下面積(AUC)與模型組比較,二者相互間無顯著性差異。說明黃連、二甲雙胍在一定程度上能增強(qiáng)胰島素敏感性,提高對血糖的調(diào)節(jié)能力。2.2對大鼠的影響各組的生化指標(biāo)檢測結(jié)果見表1,與正常組相比,模型組的TC、TG明顯升高,說明大鼠注射STZ并長期灌胃脂肪乳造成Ⅱ型糖尿病模型后,血糖、血脂升高,造成糖、脂肪代謝紊亂。與模型組相比,大鼠給藥黃連后,TC、TG分別下降了58.66%,42.18%。經(jīng)陽性對照藥二甲雙胍給藥后,TC、TG分別下降了57.29%,54.36%,說明黃連、二甲雙胍均有調(diào)節(jié)血脂的作用。2.3正常組和模型組離子分離程度分析大鼠尿樣采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析,尿樣的典型總離子流圖如圖2。通過峰檢測、匹配,并進(jìn)行變量篩選,最終生成變量數(shù)為147個(gè)的數(shù)據(jù)矩陣用于模式識(shí)別,該變量為離子碎片,信息包含離子的保留時(shí)間、質(zhì)荷比和絕對離子峰強(qiáng)度。對上述數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行PCA分析,結(jié)果見圖3,第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)包含的信息量分別為21.3%和12.3%。由圖3可知,正常組與模型組獲得明顯的區(qū)分。二甲雙胍組除有2個(gè)樣本與模型組未分開,大部分樣本與模型組有分離的趨勢。黃連組位于模型組與正常組之間,更接近于正常組。說明正常組與模型組的尿液內(nèi)源性代謝指紋存在顯著的差異,黃連與二甲雙胍的治療對內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用存在顯著的差異。2.4糖尿病大鼠單次給藥后差異開導(dǎo)性物理論依據(jù)的變化為確定與糖尿病相關(guān)的差異代謝物,采用SPSS13.0軟件對正常組與模型組的尿液代謝物進(jìn)行one-wayANOVA分析,如果p﹤0.05,該代謝物確定為與糖尿病相關(guān)的差異代謝物。代謝物通過GC-MS軟件所附的NIST02譜庫進(jìn)行譜圖檢索定性,部分代謝物采用標(biāo)準(zhǔn)對照品進(jìn)行確證,共發(fā)現(xiàn)和鑒定了12個(gè)差異代謝物,結(jié)果見圖4。與正常組比較,模型組中的羥基乙酸、2,3-二羥基丁酸、蘋果酸、丁四醇、3-羥基己二酸、阿拉伯糖醇、L-抗壞血酸顯著下降,4-甲基苯酚、苯甲酸、氨基丙二酸、1H-吲哚、核糖酸顯著上升。采用SPSS13.0軟件分別對黃連、二甲雙胍給藥組與模型組的尿液代謝物進(jìn)行one-wayANOVA分析,結(jié)果見圖4。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,糖尿病大鼠給藥黃連后有7個(gè)差異代謝物發(fā)現(xiàn)有顯著性向正常組調(diào)節(jié)的趨勢。與模型組比較,黃連組的苯甲酸、氨基丙二酸、丁四醇、核糖酸的相對含量顯著下降;2,3-二羥基丁酸、L-抗壞血酸、3-羥基己二酸的相對含量顯著上升。糖尿病大鼠給藥二甲雙胍后,發(fā)現(xiàn)3個(gè)差異代謝物有向正常組顯著性調(diào)節(jié)的趨勢。與模型組比較,二甲雙胍組的4-甲基苯酚、1H-吲哚、阿拉伯糖醇的相對含量顯著下降。2.5治療糖尿病合并癥的代謝組學(xué)研究Ⅱ型糖尿病是一種慢性代謝性疾病,主要表現(xiàn)為胰島素抵抗的葡萄糖代謝紊亂,同時(shí)伴有脂肪代謝紊亂。Ⅱ型糖尿病的動(dòng)物造模方法目前有很多種,包括遺傳性糖尿病大鼠模型、四氧嘧啶造模方法、鏈脲佐菌素造模方法、高脂飼料伴小劑量鏈脲佐菌素造模方法等。本研究考慮Ⅱ型糖尿病的造模方法要接近于人的致病原因,以及大鼠成模率要高、模型穩(wěn)定等因素,最后確定采用高脂飼料伴小劑量鏈脲佐菌素造模方法。生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明,模型組的血糖、血脂在造模后30d內(nèi)無顯著性差異,一直為高血糖、高血脂的模型,說明該造模方法穩(wěn)定、可靠。糖尿病大鼠分別給藥黃連、二甲雙胍治療后,其血糖、血脂均顯著降低,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃連、二甲雙胍均具有降血糖、降血脂的作用。對糖尿病大鼠尿樣中內(nèi)源性物質(zhì)分析后,發(fā)現(xiàn)有12個(gè)代謝物與糖尿病相關(guān)。其中4-甲基苯酚、苯甲酸、1H-吲哚這些差異代謝物與腸道菌群代謝紊亂相關(guān);有研究表明,糖尿病與腸道菌群代謝紊亂相關(guān),4-甲基苯酚、1H-吲哚是食物中蛋白質(zhì)在腸道菌群作用下的代謝產(chǎn)物,苯甲酸是含有苯基脂肪的ω-氧化分解的產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn),糖尿病模型大鼠體內(nèi)4-甲基苯酚、苯甲酸、1H-吲哚相對含量顯著性升高,分別給藥黃連、二甲雙胍治療后,這些代謝物出現(xiàn)向正常組顯著調(diào)節(jié)的趨勢,表明黃連對腸道菌群代謝紊亂可能有調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而在一定程度上發(fā)揮對高血糖的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)與糖尿病相關(guān)的代謝物中,氨基丙二酸、L-抗壞血酸亦是反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的代謝物,其中氨基丙二酸是甘氨酸氧化的一種代謝物。糖尿病患者的機(jī)體多伴有氧化應(yīng)激狀態(tài),持續(xù)的高血糖導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞線粒體生成的超氧負(fù)離子增多,蛋白質(zhì)糖基化作用增強(qiáng)等,使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài),過多的氧自由基損傷組織,增加糖尿病合并癥發(fā)生的幾率。黃連給藥后,氨基丙二酸、L-抗壞血酸均出現(xiàn)向正常組顯著調(diào)節(jié)的趨勢,這些數(shù)據(jù)表明,黃連在降低血糖的同時(shí),對機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)亦有調(diào)節(jié)作用。氧化應(yīng)激狀態(tài)能增加糖尿病患者合并癥的發(fā)生、發(fā)展,黃連對機(jī)體內(nèi)與氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)的代謝物的調(diào)節(jié)作用,表明黃連可能在一定程度上能夠預(yù)防糖尿病合并癥的發(fā)生、發(fā)展。2,3-二羥基丁酸是蘇氨酸的代謝產(chǎn)物之一,蘇氨酸是人體必需氨基酸、是一種升糖氨基酸。關(guān)