應(yīng)用dhplc技術(shù)分析pm基因多態(tài)性位點(diǎn)

應(yīng)用dhplc技術(shù)分析pm基因多態(tài)性位點(diǎn)

氨基葡萄糖轉(zhuǎn)化率（tpmt）是一種重要的抗高血壓藥物，6-merca-merca-石墨（6-merca-pm）代謝。TPMT具有遺傳多態(tài)性,TPMT缺乏的急性白血病病人,用標(biāo)準(zhǔn)劑量的6-MP治療可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TPMT等位基因有8種,均表現(xiàn)為序列上單個核苷酸的變異,即單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)。不同種族間變異的TPMT等位基因的頻率不同,而且類型也有差異,其中以TPMT基因第5外顯子G238C、第7外顯子G460A和第10外顯子A719G的3個SNP為最常見。變異的TPMT等位基因與酶活性降低有關(guān),從而影響巰嘌呤類藥物的效應(yīng)。變性高效液相色譜(denaturinghighperfomanceliquidchromatography,DHPLC)分析技術(shù)檢測基因突變的基本原理是基于異源雙鏈的形成。筆者應(yīng)用DHPLC,并結(jié)合DNA直接測序,進(jìn)行TPMT基因內(nèi)3個多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率及其分布規(guī)律的研究。1對象和方法1.1急性白酒病人標(biāo)本250例漢族健康成人(北京大學(xué)第一醫(yī)院無血緣關(guān)系的健康獻(xiàn)血員);100例漢族新生兒臍血標(biāo)本(北京大學(xué)婦兒醫(yī)院);280例急性白血病病人(1995.12～2002.1北京兒童醫(yī)院血液門診初診并住院治療的急性白血病的病人)。采集新生兒臍血標(biāo)本以及急性白血病病人標(biāo)本的收集之前均有知情同意。急性白血病病人檢測結(jié)果通知家長,并采取相應(yīng)的治療調(diào)整。本研究符合法律法規(guī)并經(jīng)倫理倫理委員會同意。1.2提取的胎盤dna采取高鹽沉淀法提取基因組DNA。1.3pcr擴(kuò)增條件根據(jù)美國麻省理工學(xué)院Whitehead研究所建立的引物設(shè)計程序,分別設(shè)計引物。引物序列為G238C:5′-CCTGCATGTTCTTTGAAACC-3′;5′-CAGGAATTTCGGTGATTGGT-3′,擴(kuò)增長度257bp;G460A:5′-CCAGGTCCACACATTCCTCT-3′;5′-TTACCATTTGCGATCACCTG-3′,擴(kuò)增長度232bp;A719G:5′-AATCCCTGATGTCATTCTTCA-3′;5′-TTCAATTCCTCAAAAACATGTCA-3′,擴(kuò)增長度219bp。PCR擴(kuò)增條件為94℃1min,94℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,反應(yīng)均為35個循環(huán)。PCR擴(kuò)增體系25μL,Tris-Cl(pH8.3)10mmol·L-1,KCl50mmol·L-1,MgCl21.5mmol·L-1,dNTPs0.2mmol·L-1,引物10pmol,DNA0.2μg,TaqDNA多聚酶1U。1.4震驚網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的基本過程1.4.1pcr產(chǎn)物的評估在不變性的溫度條件下進(jìn)行,用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定DNA片段大小,PCR產(chǎn)物的純度。1.4.2tm值的預(yù)測①溫度的選擇:應(yīng)在接近DNA解鏈溫度(Tm)附近進(jìn)行,TPMT多態(tài)性檢測時色譜柱溫的選擇與野生型Tm值有關(guān),Tm是指半數(shù)DNA雙鏈分子解鏈時的溫度,部分變性溫度即在接近Tm附近進(jìn)行檢測。計算機(jī)軟件可根據(jù)DNA序列預(yù)測Tm值,一般在Tm值上下2℃范圍內(nèi)進(jìn)行檢測。②分離梯度的選擇:將DNA序列及選擇檢驗(yàn)的方式輸入計算機(jī),軟件系統(tǒng)可自動模擬選擇最佳分離梯度。1.4.3色譜峰的個數(shù)和峰的對稱和確定①已知野生型:在不變性和部分變性溫度條件下,均為單一峰。②已知雜合子變異型:不與野生型進(jìn)行混合,經(jīng)過變性復(fù)性過程,在部分變性溫度的條件下,色譜峰的個數(shù)和峰的對稱性有改變,可與野生型比較進(jìn)行鑒別。③已知純合子變異型:需與野生型混合,經(jīng)過變性復(fù)性過程,在部分變性溫度的條件下,色譜峰的個數(shù)和峰的對稱性有改變,可與野生型比較進(jìn)行鑒別。④未知樣品:需與野生型混合,經(jīng)過變性復(fù)性過程,在部分變性溫度的條件下,若有突變則色譜峰的個數(shù)和峰的對稱性有改變,可與野生型比較進(jìn)行鑒別;若沒有突變,則為單一峰。1.5dna測序與確認(rèn)經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的片段,經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳證實(shí)后,對每一位點(diǎn)均進(jìn)行DNA測序以確認(rèn)。對DHPLC發(fā)現(xiàn)的變異峰應(yīng)用雙側(cè)引物分別測序以進(jìn)一步鑒定。1.6tpmt基因多態(tài)性頻率的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS10.0軟件進(jìn)行分析。用直接計數(shù)法計算健康成人、臍血和急性白血病病人TPMT基因中3個SNP位點(diǎn)多態(tài)性的頻率,均數(shù)比較用t檢驗(yàn),兩樣本率間的比較用四格表的χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1tm值的預(yù)測用TPMT第5外顯子引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并確認(rèn)目的片段。WAVEmaker軟件根據(jù)此區(qū)的DNA序列預(yù)測Tm值,根據(jù)DNA溶解曲線(圖1),確定柱箱溫度為53℃,用體積分?jǐn)?shù)為48%乙腈洗脫。全部630例DNA標(biāo)本的色譜峰均為單峰。將單峰標(biāo)本進(jìn)行1∶1混合后重新進(jìn)樣也為單峰,未篩選出雜合峰,即無純合變異。此結(jié)果與酶消化法的一致率為100%。2.2柱箱溫度和雜合峰的關(guān)系用TPMT第7外顯子的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并確認(rèn)目的片段。WAVEmaker軟件根據(jù)此區(qū)DNA序列預(yù)測Tm值,根據(jù)DNA溶解溫度曲線選擇柱箱溫度為57℃,見圖2,用體積分?jǐn)?shù)為47%乙腈洗脫。在全部630例標(biāo)本中,316例標(biāo)本為單峰,而214(34%)為雜合峰,均為4條峰,此結(jié)果與酶切不符。將單峰標(biāo)本進(jìn)行1∶1混合后重新進(jìn)樣,出現(xiàn)2例雜合峰,提示可能有純合變異。分別選擇5例首次進(jìn)樣和混合進(jìn)樣出現(xiàn)雜合峰的標(biāo)本進(jìn)行DNA測序分析,結(jié)果證實(shí)此區(qū)無序列變異。將柱箱溫度從54～60℃逐漸升高,觀察色譜峰的變化,結(jié)果顯示,雜合峰標(biāo)本在54和60℃為單峰,55～59℃均為雜合峰,但57℃峰形最好。而單峰標(biāo)本峰形未隨溫度發(fā)生變化。說明DHPLC的檢測誤差并不是柱箱溫度不合適引起的。2.3tm值的預(yù)測用TPMT第10外顯子區(qū)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并確認(rèn)目的片段。WAVEmaker軟件根據(jù)此區(qū)DNA序列預(yù)測Tm值,根據(jù)DNA溶解溫度曲線選擇柱箱溫度為54℃,見圖3。用體積分?jǐn)?shù)為46%乙腈洗脫。在全部630例標(biāo)本中,608例為單峰,雜合峰為22例,將各單峰標(biāo)本進(jìn)行1∶1混合后重新進(jìn)樣無雜合峰出現(xiàn)。10例雜合峰標(biāo)本進(jìn)行DNA直接測序,證實(shí)結(jié)果為雜合變異。此結(jié)果與酶切的一致率為100%。3dhplc檢測tpmt基因的位點(diǎn)及誤差DHPLC是一種新型的高通量篩選DNA序列變異的技術(shù)。該方法具有自動化、快速、檢出率高、檢出DNA片段大小范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)行基因變異檢測是基于異源雙鏈的形成。為快速以高通量篩選出TPMT基因的SNP,并且引證和補(bǔ)充酶切結(jié)果,我們建立了DHPLC。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,一個標(biāo)本在8min內(nèi)完成檢測全過程,具有迅速的特點(diǎn)。通過對所研究人群的DNA標(biāo)本應(yīng)用DHPLC檢測TPMT基因的3個SNP位點(diǎn),并經(jīng)DNA直接測序證實(shí):健康成人、臍血和急性白血病3種人群,630例DNA樣本,TPMT基因外顯子區(qū)的3個位點(diǎn)的多態(tài)性頻率為3.49%,遠(yuǎn)低于白種人(7.4%～13.6%)和非洲人(10.9%～14.4%)。變異的位點(diǎn)為第10外顯子A719G,即變異的等位基因?yàn)門PMT*3C,且均為雜合變異,未發(fā)現(xiàn)純合