第3章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法-2016

1Chapter3細(xì)胞生物學(xué)研究方法23.1顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。肉眼：0.2mm;光鏡：0.2μm;電鏡：0.2nm33.1.1光學(xué)顯微鏡技術(shù)1.普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)相差顯微鏡技術(shù)微分干涉差顯微鏡技術(shù)5.暗視野顯微鏡技術(shù)5.熒光顯微鏡技術(shù)6.激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)41.普通光學(xué)顯微鏡（TheLightMicroscope）1)結(jié)構(gòu)顯微鏡的分辨力由哪部分決定？5分辨率

R=0.61λ/NANA

（數(shù)值孔徑）

λ=照明光源的波長，白光約為500nm。如40/0.65100/1.4R=0.61λ/NA=0.61X0.5/1.4=0.2

m

2）性能指標(biāo)6

3）總放大率：

物鏡的放大倍數(shù)X目鏡的放大倍數(shù)

目鏡的放大倍數(shù)：10X16X

有效放大率：

所用物鏡數(shù)值孔徑的500-1000倍.

空放大：在有效放大外，屬于空放大。微細(xì)結(jié)構(gòu)分辨不清。

任何顯微鏡而言，最重要的是其分辨力！

而不是它的放大倍數(shù)。

74)

目鏡的作用：與顯微鏡的分辨率無關(guān)，它只是把物象第二次放大，使眼睛便于觀察。目鏡只能將物鏡已經(jīng)分辨的影像進(jìn)行放大，無法觀察到未被物鏡分辨的細(xì)節(jié)。問題：使用40/0.65物鏡時，應(yīng)選配適宜目鏡5）應(yīng)用：經(jīng)過固定染色后，切片標(biāo)本的觀察。8移動臂蠟或樹脂包埋的樣品切片用鋼刀樣品切片蠟帶伸展在蓋玻片和載玻片之間的切片切片機(jī)石蠟切片樣品制備：

1).固定；2).脫水、包埋；3).切片；4).選擇性染色；

5).觀察。固定劑（甲醛）乙醇脫水二甲苯石蠟包埋9VWAp27

TUNEL10染色細(xì)胞未染色細(xì)胞光線通過染色的細(xì)胞，振幅變低。光線通過未染色的細(xì)胞，振幅不變，但相位發(fā)生改變。利用光衍射和干涉特性，通過添加物鏡后焦面上相板和聚光鏡上的環(huán)狀光柵，使相位差變?yōu)檎穹?，提高明暗對比?.相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)11在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。12Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.13衍射光的相位比直射光推遲

1/4波長明反差（負(fù)反差）：將直射光推遲1/4入，使直射光和衍射光，維持同一相位，由于干涉現(xiàn)象，合成光的振幅是二者振幅之和，而背景只有直射光，所以被檢物體比背景亮。暗反差（正反差）：將衍射光推遲1/4入，由于直射光和衍射光的干涉作用，合成光的振幅是直射光與衍射光的差，而背景只有直射光，所以背檢物體比背景暗。優(yōu)點：可對未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞進(jìn)行顯微內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察，提高分辨率143.微分干涉差顯微鏡（differential-interferencemicroscopy）利用的是偏振光，這些光經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后在經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光匯合，從樣品中厚度上的微小區(qū)別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差并且具有很強(qiáng)的立體感。一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強(qiáng)，適合于顯微操作，影像具有浮雕感。15

丁達(dá)爾效應(yīng)原理分辨力：0.004um

利用特殊聚光器，使照明光線不能進(jìn)入物鏡，經(jīng)過標(biāo)本的散射光進(jìn)入物鏡放大。 觀察樣品結(jié)構(gòu)的明亮輪廓，如活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體等，但分辨不清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。4.暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)16

(A)普通光學(xué)顯微鏡(B)相差顯微鏡

(C)微分干涉差顯微鏡(D)暗視野顯微技術(shù).175.倒置顯微鏡18倒置：物鏡在載物臺之下，照明系統(tǒng)在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差物鏡。196.熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)原理：

熒光物質(zhì)經(jīng)波長較短的光線照射后分子被激活，吸收能量后處于激發(fā)態(tài)釋放能量，其能量一部分轉(zhuǎn)化為熱能，大部分能量則以波長較長的光能—熒光形式輻射出來。應(yīng)用：檢測細(xì)胞上的特異熒光染料。20第一濾光片第二濾光片平面反射鏡物鏡儀器：光源，濾色裝置高壓汞燈2122應(yīng)用：定性、定位研究熒光標(biāo)記物：異硫氰酸熒光素(FITC),

rhodamine.23多種熒光探針著絲點:紅色DNA：藍(lán)色紡錘體微管：綠色DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)24257.激光掃描共聚焦顯微鏡

(laserscanningconfocalmicroscope)26原理原理

激光光源通過一個微小縫隙，打到一個二向色鏡。由鏡子反射的光線通過物鏡、聚焦在樣品的一個層面上。樣品被激發(fā)后發(fā)出較長波長的光，通過物鏡成像、聚焦在顯微鏡中的一個針孔縫隙中，而來自其它層面的光線被擋板擋住。圖像通過信號放大傳輸?shù)接嬎銠C(jī)中。27特點：單色激光形成的點光源光點掃描–

二維圖像改變焦平面—

三維重建處理優(yōu)點：使圖像異常清晰，提高靈敏度和分辨率28腸胚期果蠅胚胎細(xì)胞微絲的常規(guī)和confocal熒光顯微鏡的圖像比較293.1.2電子顯微鏡(electronmicroscope)透射電鏡（transmissionelectronmicroscope，TEM）掃描電鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）30原理：電子束:波長比光線的波長短得多。λ=(150/v)1/2

電磁透鏡:在電鏡中造成磁場的精密線圈，由磁或電所形成的磁場或電場的局部空間起到透鏡作用

分辨率：0.2nm，生物樣品：1nm31原理：電子束:波長比光線的波長短得多。λ=(150/v)1/2

電磁透鏡:在電鏡中造成磁場的精密線圈，由磁或電所形成的磁場或電場的局部空間起到透鏡作用

分辨率：0.2nm，生物樣品：1nm32原理：電子束:波長比光線的波長短得多。電磁透鏡:在電鏡中造成磁場的精密線圈，由磁或電所形成的磁場或電場的局部空間起到透鏡作用

分辨率：0.2nm，生物樣品：1nm33各種光及電子束的波長341.透射電子顯微鏡1）結(jié)構(gòu)351).光源,電子槍2).非真空，真空3).玻璃，電磁透鏡投影鏡熒光屏或感光膠片成像直接觀察物像聚光鏡物鏡目鏡363）樣品制備：固定：戊二醛和四氧化鋨乙醇、丙酮系列脫水環(huán)氧樹脂包埋超薄切片：40~50nm電子染色：醋酸鈾、檸檬醋鉛增加反差37超薄切片銅網(wǎng)38392.冷凍蝕刻技術(shù)（freeze-etching）電鏡觀察的樣品不能太厚，當(dāng)樣品太厚時電子不能穿透，就需要把樣品本身去掉，此技術(shù)是便于透射電子顯微鏡觀察的一種技術(shù)。 亦稱冰凍斷裂(freeze-fracture)，是研究生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的一種有用的技術(shù)，關(guān)于膜結(jié)構(gòu)的許多資料即是利用這種方法取得的。40冷凍斷裂蝕刻復(fù)型融化組織將標(biāo)本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低溫冰凍。然后用冷刀驟然將標(biāo)本沖斷開，升溫后冰在真空條件下迅即升華，暴露出了斷裂面結(jié)構(gòu)——蝕刻(etching)。技術(shù)過程蝕刻斷裂41剩復(fù)型膜觀察

45

噴鉑金垂直噴碳加固融組織冰升華立體感強(qiáng)，分辨率高，主要用于生物膜結(jié)構(gòu)的研究。

復(fù)型膜：樣品用重金屬傾斜投影后再用碳垂直噴鍍一次，以形成一層連續(xù)的碳膜，然后以強(qiáng)力的消化劑將生物樣品腐蝕掉。這樣就只剩下一層可在透射電鏡下觀察的帶有重金屬造成的影像的碳膜，稱為復(fù)型膜。42P:protoplasmicfaceE:exoplasmicface原生質(zhì)面外質(zhì)面43冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)制備的細(xì)胞斷面443.掃描電子顯微鏡

(scanningelectronmicroscope)45透鏡：匯聚電子束偏轉(zhuǎn)器掃描發(fā)生器透鏡在觀察屏成像檢測器：

1）原理：電子探針受掃描發(fā)生器控制，在樣品表面逐點逐線地掃描，樣品被電子轟擊所產(chǎn)生的二次電子信號被收集、轉(zhuǎn)換、放大，在熒光屏上同步掃描成像。樣品發(fā)射電子多的地方，在熒光屏上相應(yīng)的點就亮，反之則暗。加熱的燈絲(電子發(fā)射源)462）樣品制備：

固定：戊二醛和四氧化鋨乙醇、丙酮系列脫水CO2臨界點干燥法：防止樣品脫水干燥中表面張力造成的變形噴鍍：為了改善二次電子發(fā)放的性質(zhì)及防止電荷積累（金或鉑）47蛙內(nèi)耳毛細(xì)胞掃描電鏡投影圖3）特點及應(yīng)用：

成像具強(qiáng)烈的立體感，適于觀察精細(xì)的立體表面結(jié)構(gòu)。

分辨率較低（3nm），不能觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)。484.掃描隧道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope,STM)掃描探針（金屬針尖）對樣品表面進(jìn)行掃描。針尖和樣品之間會產(chǎn)生隧道電流。針尖和樣品間距離的微小變化轉(zhuǎn)換為隧道電流的變化。49將探針接近被測樣品，并在其間加2-10伏的小電壓，當(dāng)兩者距離十分小時（約1納米），電子就可因量子隧道效應(yīng)在沒有接觸的針尖和樣品間流動，即產(chǎn)生了隧穿電流。保持兩者的距離不變，隧穿電流也保持不變。隧穿電流對針尖和樣品間距離的微小變化異常敏感如針尖在樣品表面掃描時改變1個原子大小的間距，隧穿電流即可變化1000倍

5051優(yōu)點：

高分辨率。具有原子級的空間分辨率。橫向空間分辨率為0.1nm，縱向為0.001nm。不需任何透鏡，體積小。缺點：是其檢查的對象必須是導(dǎo)電體，而生物樣品的導(dǎo)電性很差，這是限制其在生命科學(xué)研究中應(yīng)用的主要因素。525.原子力顯微鏡

(AtomicForceMicroscopy)不再要求樣品是導(dǎo)電體用于檢查不導(dǎo)電的樣品的形貌并能得到清楚的圖像。但分辨率比掃描隧道顯微鏡要低，比掃描電鏡高。53當(dāng)探針尖端與樣品表面接觸時，依其作用力作用(吸力或斥力)，使得懸臂彎曲，依據(jù)角度的變化，造成二極體電流改變。由測量電流的變化可得知懸臂彎曲程度，輸入電腦產(chǎn)生樣品表面三維影像。不論絕緣體、半導(dǎo)體、導(dǎo)體都一樣可以獲得三維空間影像。54原子力顯微鏡肺癌A549細(xì)胞551.離心技術(shù)(Centrifugation)

原理： 利用細(xì)胞內(nèi)各種成分的大小、形 狀和密度不同，采用不同的離心 力將之分離。

分類：差速離心、密度梯度離心2.2細(xì)胞組分的分析方法561).差速離心

（differentialcentrifugation）原理：主要根據(jù)被分離物質(zhì)的大小差異。體積大的沉降得快，反之沉降得慢。用途：分離體積相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。57差速離心-介質(zhì)密度均一，遞增速度逐級離心58差速離心I組織勻漿低速離心1,000g10分沉淀含：細(xì)胞核59差速離心II沉淀含：線粒體、溶酶體、過氧化物酶體將上清中速離心20,000g10分60差速離心III將上清高速離心80,000g1小時沉淀含：微粒體小泡61微粒體是指在細(xì)胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分。62差速離心IV將上清超速離心150,000g3小時沉淀含：核糖體,病毒大分子632)密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；PH中性或易調(diào)為中性；濃度大時滲透壓不大；對細(xì)胞無毒。速度沉降離心特點：常用蔗糖或甘油制備輕微的連續(xù)密度的介質(zhì)，將待分離的樣品加在離心管的最上層。在離心過程中，體積、密度不同的顆粒就會以不同的沉降帶分開，最后收集各區(qū)帶。用途：分離體積大小稍微不同、密度相近的顆粒。65特點：

在密度連續(xù)梯度的介質(zhì)中，將細(xì)胞勻漿置于介質(zhì)的頂部，離心使勻漿中的不同組分沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡。各沉降帶可分別收集。用途：分離密度不同的顆粒常用介質(zhì)：蔗糖(5%~20%)、CsCI等密度離心（density-gradient equilibriumcentrifugation）66速度沉降離心等密度離心樣品蔗糖的穩(wěn)定梯度慢速沉降成分快速沉降成分樣品蔗糖的不連續(xù)梯度低浮力密度成分高浮力密度成分68優(yōu)點：可以對細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器的化學(xué)組成進(jìn)行直接的定量分析。缺點：

1.分離細(xì)胞器時難免混入少量其他