木豆葉藥材高效液相指紋圖譜研究

木豆葉藥材高效液相指紋圖譜研究

木豆葉是豆科植物cajan（l.）milsp的干燥葉子。藥材主要分布于長江以南的云南、海南、廣西、貴州、廣東以及福建、湖南、四川、江西、浙江、臺灣等省區(qū),可用于治療股骨頭壞死、燒傷、褥瘡等。目前,木豆葉的質(zhì)量控制多采用牡荊苷、異牡荊苷作為指標,但僅僅依靠單一或幾個化學成分并不能反映藥材中其他成分的情況。鑒于色譜指紋圖譜的方法可以有效地評價藥材質(zhì)量,故本實驗采用HPLC法,建立木豆葉藥材的指紋圖譜,并對來自海南的10批木豆葉藥材進行比較研究,以期為其鑒別與質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。1設備和材料1.1sartornus萬分之電子天平2s,cw日本島津高效液相色譜儀(型號:LC-20A(UV/Vis));Sartorius萬分之一電子天平(型號:BSA224S-CW);Sartorius十萬分之一電子天平(型號:CP225D);數(shù)控超聲清洗器(型號:KQ5200DA)。1.2試劑與藥品試劑甲醇(天津市大茂化學試劑廠,分析純;德國Merck公司,色譜純)、乙醇(天津市大茂化學試劑廠,分析純)、冰乙酸(天津市大茂化學試劑廠,分析純)、重蒸去離子水(實驗室制備);牡荊苷對照品(批號:111687-200602)購于中國藥品生物制品檢定所;木豆葉藥材來源見表1,由廣州中醫(yī)藥大學中藥學院賴小平教授鑒定為豆科植物木豆Cajanuscajan(L.)Millsp的干燥葉片。2方法和結(jié)果2.1無砂速度柱色譜柱:DiamonsilC18(2)(250mm×4.6mm,5μm);MeOH(A)-1%HAc(B)為流動相梯度洗脫::0～10min(10%A～20%A),10～40min(22%A～24%A),40～65min(24%A～33%A),65～80min(33%A～70%A),80～100min(70%A～80%A),100～115min(80%A-93%A),115～125min(100%A);流速:1.0mL/min;柱溫:40℃;進樣體積:10μL;檢測波長:268nm。2.2對照溶液的制備取牡荊苷對照品適量,用甲醇制成每1mL含40.4μg的對照品溶液。2.3提取微孔濾膜取各批木豆葉藥材粉末約5.0g,精密稱定,置于錐形瓶中,加入蒸餾水100mL,加熱回流提取1h,放冷,過濾,濾液用蒸餾水定容至100mL,過0.45μm微孔濾膜,即得。2.4測量分別精密吸取供試品溶液10μL,注入液相色譜儀,記錄120min色譜圖。2.5儀器精密度驗證取同一供試品溶液,連續(xù)進樣5次。結(jié)果色譜圖中各共有峰的相對保留時間的RSD小于0.1%,相對峰面積的RSD小于2%,符合指紋圖譜要求,表明儀器精密度良好。2.6溶液穩(wěn)定性測定取同一供試品溶液,分別在0、2、6、18、24h進樣測定,結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD小于0.5%,相對峰面積的RSD小于2%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.7重復性試驗取同一批號藥材5份,照“2.3”項下方法制備供試品溶液,進樣檢測,結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD小于0.5%,相對峰面積的RSD小于3%,表明方法的重復性良好。2.8指紋譜的構(gòu)建和分析2.8.1色譜圖17號峰在10批樣品的色譜圖17號峰在10批樣品的色譜圖中的值將10批木豆葉藥材的指紋圖譜進行匹配(見圖1),結(jié)果1～7號峰在10批樣品的色譜圖中均出現(xiàn)。因此標定此7個峰為共有指紋峰,并據(jù)此建立木豆葉藥材的HPLC指紋圖譜,見圖2。2.8.2峰的相對保留時間和峰面積以牡荊苷色譜峰的保留時間和峰面積為1,計算其他各峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果見表2,表3。由表2和表3可見,各批供試品指紋圖譜的重現(xiàn)性較好,但各批樣品間共有指紋峰的相對峰面積有一定差異。2.8.3相似度評價結(jié)果將色譜工作站數(shù)據(jù)導入國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版,通過相似度計算軟件得出木豆葉指紋圖譜的共有模式,并以此共有模式為標準,對每批藥材進行相似度評價,結(jié)果見表4,表明海南產(chǎn)木豆葉相似度較高。3討論3.1最大吸收的部位取木豆葉藥材供試品溶液進行紫外掃描,結(jié)果在268和330nm有較強的吸收,且在268nm有最大吸收。檢測波長在268nm時,色譜峰數(shù)量較多,基線平穩(wěn),且各峰分離度較好,故選定268nm作為檢測波長。3.2流動相梯度洗脫優(yōu)化實驗過程中選擇了多種流動相系統(tǒng)梯度洗脫方式:甲醇-水、乙腈-水、乙腈-1%冰醋酸水溶液、甲醇-1%冰醋酸水溶液,并對梯度洗脫程序進行優(yōu)化,結(jié)果表明:以甲醇-1%冰醋酸水溶液為流動相梯度洗脫時,洗脫效果最佳,各色譜峰分離度較好,峰型尖銳,保留時間適中。3.3細胞培養(yǎng)液f、platorislrtrap/kromasil的5-5-4.5e-ms10.6m、kromasil1.4.5.4.5.5.5.5.4.7m實驗中對以下5種不同品牌色譜柱進行了考察:DiamonsilC18(2)(250mm×4.6mm,5μm)、Phenomenexsynergi4μFusion-RP80(250mm×4.6mm,5μm)、PlatisilTMODS(250mm×4.6mm,5μm)、Kromasil100-5C18(250mm×4.6mm,5μm)和CapcellPakC18UG120S5(250mm×4.6mm,5μm)。結(jié)果DiamonsilC18(2)(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱相對于另外4種色譜柱而言,出峰數(shù)量較多,峰形對稱性好,且分離度較高,故選之。3.4樣品溶液的制備實驗中比較了水提法、水提-石油醚萃取法和水提-石油醚萃取-不同濃度醇沉法三種樣品提取方法,結(jié)果顯示三種方法出峰數(shù)量、峰形及分離度均無明顯差別,因此選用最為簡便的水提法制備供試品溶液。3.5批木豆葉藥材之間比較木豆葉中主要含有牡荊苷、異牡荊苷、木犀草素、芹菜素、柚皮素-4,7二甲醚等黃酮類成分,從木豆葉對照指紋圖譜(圖2)上可以看出,其中牡荊苷的峰高適中,與相鄰峰的分離度較好,故將牡荊苷定為參照峰。從10批木豆葉藥材指紋相似度結(jié)果可以看出,同一產(chǎn)地的木豆葉指紋圖譜相似度較高,均大于0.9。但是,各峰相對峰面積有一定的差異,說明藥材之間的內(nèi)在質(zhì)量是有差異的。實驗結(jié)果表明,通過指紋圖譜整體圖形、共有特征峰、相對保留時間等參數(shù)可對藥材進行鑒定,通過各共有峰相對峰面積可對