藥用植物杜鵑遠(yuǎn)緣雜交親和性研究

藥用植物杜鵑遠(yuǎn)緣雜交親和性研究

我國野生杜鵑資源豐富，占世界杜鵑資源的一半以上，但我國對杜鵑資源的應(yīng)用和研究，尤其是新品種的創(chuàng)造，尚處于張長欽、劉曉青等報(bào)道的階段。關(guān)于國外花卉育種的研究正在進(jìn)行，關(guān)于花卉育種的許多報(bào)告也有發(fā)表。2002年，記錄了2800種花卉新品種。杜鵑與后代的混合授粉障礙表現(xiàn)為預(yù)處理前后的障礙。隨著杜鵑育種的混合，花粉基本上可以在根部發(fā)芽，但如果枝條表面出現(xiàn)體積物質(zhì)，則花粉管可能無法進(jìn)入石柱。進(jìn)入柱子后，花粉管也會(huì)出現(xiàn)頂部腫脹、變形和停止生長的現(xiàn)象，或者花粉管不能進(jìn)入毛囊，也可能會(huì)因?yàn)樾螤詈秃蟠倪^度生長而阻礙生長。花粉管的生長障礙可能發(fā)生在不同的部分。不同的混合組合導(dǎo)致花粉管生長障礙的部分。據(jù)報(bào)道，蒙古族授粉和積極己烷處理可克服杜鵑精前的障礙。精后缺陷主要表現(xiàn)為卵巢發(fā)育不足，種子發(fā)芽率低，后代有白苗。繁殖是克服精細(xì)缺陷的有效技術(shù)手段。也報(bào)告了杜鵑育種。多年生杜鵑與黃女白杜鵑雜交后，白苗通常發(fā)生在白苗上。ure西林奧爾德利用三、回交和雙重雜交等有效克服了篩選后的障礙，并接收了綠色幼苗。近年來,各地紛紛展開了野生杜鵑的引種馴化工作,但由于野生杜鵑大多分布在高山地區(qū),生長發(fā)育要求冷涼的環(huán)境條件,對高溫的忍耐力不強(qiáng),杜鵑屬植物,尤其是常綠品種的引種栽培至今沒有成功.高溫脅迫嚴(yán)重影響了杜鵑花在我國城市中的推廣應(yīng)用.因此該研究以培育耐熱性強(qiáng)、生態(tài)適宜范圍廣的杜鵑新品種為目的,以南京地區(qū)栽培的耐熱性較好的映山紅(Rhododendronsimsii)和錦繡杜鵑(Rhododendronpulchrum)為母本,自交的同時(shí),與高海拔地區(qū)引種的杜鵑屬其他各種進(jìn)行雜交.利用熒光顯微鏡觀察這些雜交組合授粉后花粉管的生長狀況,分析其遠(yuǎn)緣雜交親和性的同時(shí),進(jìn)一步明確杜鵑雜交存在的種間雜交受精前、后障礙,為我國野生杜鵑的雜交育種提供理論依據(jù).1材料和方法1.1野生認(rèn)為是植物表1和表2.以南京地區(qū)栽培的映山紅(R.simsii)、錦繡杜鵑(R.pulchrum)為母本,自交的同時(shí),以表1所列野生杜鵑種為父本(花粉來自中科院昆明植物園),配置雜交組合.1.2花粉管生長數(shù)量和異常花粉管比率的測定2011年4月中旬開花前3d對母本進(jìn)行去雄套袋,待柱頭分泌大量黏液時(shí)選擇于當(dāng)天上午9:00—12:00進(jìn)行常規(guī)人工授粉,各組合至少重復(fù)15朵花.授粉24、48、72h后采集花柱及子房,每個(gè)雜交組合取5朵花.參照Ureshino等的方法,將柱頭等用FAA液固定24h后,置于70%的酒精內(nèi),于4℃條件下保存,用于解離、染色和觀察.用3mol·L-1的NaOH溶液45℃水浴解離3h,解離前后都要用蒸餾水沖洗,然后用0.1%的苯胺藍(lán)(0.1mol·L-1K3PO4·7H2O緩沖液)染色3h,壓片后使用LeicaDM500B熒光顯微鏡觀察、拍照.統(tǒng)計(jì)花粉管生長數(shù)量及其異常花粉管的比率.2結(jié)果與分析2.1花粉管及帶骨參天山帶骨首具解決去級(jí)雜交授粉后花粉管生長狀況如圖1所示.圖1中:(1)映山紅×白花杜鵑,花粉管在柱頭萌發(fā),并向下開始生長(箭頭所示);(2)映山紅×白花杜鵑,花粉管在柱頭上部生長,部分花粉管出現(xiàn)膨大、扭曲生長(箭頭所示);(3)映山紅×白花杜鵑,花粉管在柱頭下部生長,胼胝質(zhì)規(guī)則分布(箭頭所示);(4)映山紅×白花杜鵑,雜交授粉3d后花粉管進(jìn)入胚囊;(5)錦繡杜鵑×薄皮杜鵑,授粉5d后,大多花粉管在柱頭纏繞(箭頭所示),沒有進(jìn)入花柱道,花粉管有胼胝質(zhì)不規(guī)則沉積(箭頭所示);(6)映山紅×薄皮杜鵑,花粉管粗細(xì)不均(箭頭所示);(7)錦繡杜鵑×滇南杜鵑,花粉管在柱頭表面打結(jié)(箭頭所示);(8)映山紅×滇南杜鵑,花粉管在花柱內(nèi)螺旋、打結(jié)(箭頭所示);(9)映山紅×露珠杜鵑,花粉管破裂(箭頭所示);(10)錦繡杜鵑×薄皮杜鵑,花粉管螺旋生長、粗細(xì)不均(箭頭所示);(11)錦繡杜鵑×紅露珠杜鵑,先端沉積胼胝質(zhì)塞(箭頭所示);(12)錦繡杜鵑×睫毛杜鵑,花粉管卷曲、雜亂生長(箭頭所示);(13)錦繡杜鵑×露珠杜鵑,花粉管尖端膨大成氣球狀(箭頭所示);(14)映山紅×滇南杜鵑,雜交后子房未見膨大,但雜交24h后花粉管就進(jìn)入胚囊(箭頭所示);(15)映山紅×美容杜鵑,花粉管在子房內(nèi)螺旋生長(箭頭所示);(16)映山紅×映山紅(昆明),花粉管正常生長.總之,該試驗(yàn)所配置的雜交組合中,所有花粉在授粉1d后都能在柱頭萌發(fā),雜交親和的花粉在花柱上部花粉管也部分出現(xiàn)異常,但大多數(shù)花粉仍能繼續(xù)生長進(jìn)入胚囊(圖1(1)~1(4)).雜交親和性較差的組合,如圖1(5)所示,錦繡杜鵑×薄皮杜鵑在授粉5d后大多數(shù)花粉還在柱頭盤旋,沒有進(jìn)入花柱.所有雜交組合花粉管生長狀況的觀察結(jié)果表明,花粉管異?，F(xiàn)象主要表現(xiàn)為花粉管粗細(xì)不均、螺旋、破損、尖端膨大、雜亂生長、胼胝質(zhì)沉積等異常情況(圖1(6),圖1(9)~1(15)),少數(shù)組合出現(xiàn)花粉管打結(jié)現(xiàn)象(圖1(7)和1(8)),如映山紅×大字杜鵑、映山紅×薄皮杜鵑、錦繡杜鵑×美容杜鵑、錦繡杜鵑×薄皮杜鵑等.還有一些雜交組合,如錦繡杜鵑×薄皮杜鵑、映山紅×薄皮杜鵑出現(xiàn)較多的異常類型.2.2不同混合組合的花粉管生長2.2.1花粉管異?，F(xiàn)象如圖2所示,以映山紅作為母本時(shí),所有雜交組合的花粉在授粉24后,映山紅自交、映山紅×映山紅(昆明)、映山紅×薄皮杜鵑以及映山紅×滇南杜鵑組合的花粉管已穿過花柱進(jìn)入子房.其他雜交組合,其父本花粉也都能夠在柱頭表面萌發(fā),但進(jìn)入花柱通道內(nèi)的花粉管數(shù)量及異常花粉管的比率,因雜交組合不同而有所不同.進(jìn)入花柱的花粉管數(shù)量大于50根的父本花粉,包括睫毛杜鵑、白花杜鵑、紅花露珠杜鵑以及映山紅自交花粉,但紅花露珠杜鵑以及映山紅自交花粉有70%以上出現(xiàn)花粉管異?，F(xiàn)象.大白杜鵑、美容杜鵑、馬纓杜鵑及大字杜鵑萌發(fā)花粉中,進(jìn)入花柱的花粉管數(shù)量較少,不到20根,但異常花粉管比例也有所降低.另外,映山紅×露珠杜鵑的雜交花粉,進(jìn)入花柱的花粉管數(shù)量較少,但異?；ǚ酃艿谋壤芨?授粉72h后,大部分雜交組合進(jìn)入花柱中的花粉管數(shù)量均多于授粉后24h,但映山紅×馬纓杜鵑組合進(jìn)入花柱的花粉管數(shù)量未見增加,仍少于20.并且隨著進(jìn)入花柱花粉管數(shù)量的增加,部分雜交組合,如映山紅×睫毛杜鵑和映山紅×大白杜鵑異?；ǚ酃艿谋壤苍谠黾?除了映山紅×露珠杜鵑、映山紅×大字杜鵑、映山紅×馬纓杜鵑、映山紅×白花杜鵑以及映山紅×窄葉杜鵑以外,大部分雜交組合在授粉72h后,花粉管都伸入了子房.授粉120h后,各組合花粉管進(jìn)入花柱的數(shù)量也有所增加(>20根),且各進(jìn)入花柱的花粉管均能到達(dá)花柱底部.但個(gè)別組合,如映山紅×薄皮杜鵑、映山紅×滇南杜鵑異?；ǚ酃艿谋壤龈?主要表現(xiàn)為較嚴(yán)重的胼胝質(zhì)沉積、花粉管破裂等現(xiàn)象.其他組合也存在花粉管異常現(xiàn)象,但比例較低,如映山紅×睫毛杜鵑、映山紅×露珠杜鵑、映山紅×大字杜鵑、映山紅×馬纓杜鵑、映山紅×美容杜鵑.2.2.2花粉管異常生長規(guī)律授粉后花粉管在錦繡杜鵑柱頭中生長狀況及異常花粉管比例如圖3所示.由圖3可知,以錦繡杜鵑作為母本時(shí),不同種類父本各花粉雖然亦能在柱頭表面萌發(fā),但花粉粒附著數(shù)量、萌發(fā)數(shù)量與花粉管長度等卻存在顯著差異.授粉24h后,大部分組合花粉在柱頭的附著量都較多,但白花杜鵑、窄葉杜鵑和滇南杜鵑花粉在母本柱頭的附著量較少,并且除錦繡杜鵑×滇南杜鵑以外各組合花粉管均能通過柱頭進(jìn)入花柱.有部分組合萌發(fā)的花粉管數(shù)量在50根以上,如錦繡杜鵑×映山紅、錦繡杜鵑×大字杜鵑與錦繡杜鵑×睫毛杜鵑,但花粉管異常的比率高達(dá)31%~100%.與映山紅為母本的雜交組合相比,大部分組合花粉管數(shù)量都比較少,并且可以發(fā)現(xiàn),除了錦繡杜鵑×薄皮杜鵑、錦繡杜鵑×美容杜鵑、錦繡杜鵑×馬銀花與錦繡杜鵑×白花杜鵑以外,較多花粉管存在胼胝質(zhì)過量沉積或者粗細(xì)不一現(xiàn)象.同時(shí),僅部分組合的花粉管能夠在24h內(nèi)達(dá)到花柱底部,如錦繡杜鵑×映山紅、錦繡杜鵑×大白杜鵑與錦繡杜鵑×白花杜鵑.與授粉第24h相比,授粉72h后,大部分雜交組合中進(jìn)入花柱的花粉管數(shù)量都有所增加,但是穿過花柱進(jìn)入子房的雜交組合數(shù)量并未增多,僅部分組合的花粉管繼續(xù)向下生長,如錦繡杜鵑×紅花露珠杜鵑、錦繡杜鵑×大字杜鵑、錦繡杜鵑×馬纓杜鵑、錦繡杜鵑×窄葉杜鵑、錦繡杜鵑×馬銀花、錦繡杜鵑×滇南杜鵑,其中錦繡杜鵑×紅花露珠杜鵑、錦繡杜鵑×大字杜鵑、錦繡杜鵑×馬銀花與錦繡杜鵑×滇南杜鵑等組合的花粉管的70%都存在異常現(xiàn)象.授粉后120h后,包括自交在內(nèi)的14個(gè)雜交組合當(dāng)中,有8個(gè)雜交組合的花粉管進(jìn)入花柱底部,其中錦繡杜鵑自交、錦繡杜鵑×映山紅(昆明)、錦繡杜鵑×白花杜鵑有較多花粉管到達(dá)花柱底部(>50根),異?；ǚ酃軘?shù)量較少(<30%),其他5個(gè)組合進(jìn)入花柱底部的花粉管數(shù)量較少,并且錦繡杜鵑×紅花露珠杜鵑、錦繡杜鵑×馬纓杜鵑及錦繡杜鵑×美容杜鵑3個(gè)組合的異?；ǚ酃鼙壤^高.3粉管進(jìn)入細(xì)胞結(jié)構(gòu)親和性授粉在花柱道和胎盤凹槽生長期間,花粉管是直的、末端半透明(稱為帽區(qū)),在帽區(qū)后邊相隔一定距離有規(guī)則的胼胝質(zhì)沉積.映山紅、錦繡杜鵑自交、雜交后,花粉管的生長出現(xiàn)扭曲、螺旋、膨大、斷裂和胼胝質(zhì)過量沉積等異常情況.Williams等在杜鵑遠(yuǎn)緣雜交時(shí)還發(fā)現(xiàn)受精后花粉管末端漸縮、有尖刺等其他花粉管生長異?，F(xiàn)象.花粉管異常情況出現(xiàn)的類型與雜交親和性無直接聯(lián)系,即使自交的組合也發(fā)現(xiàn)花粉管螺旋、破損、胼胝質(zhì)過量沉積等異常的情形,部分組合如:錦繡杜鵑×薄皮杜鵑雜交組合,除以上異常狀況外,還發(fā)現(xiàn)花粉管打結(jié)、雜亂生長、先端膨大等異常,在所有異常情況中較多組合出現(xiàn)花粉管胼胝質(zhì)過量沉積、螺旋,而花粉管打結(jié)現(xiàn)象較少.根據(jù)Williams等在杜鵑花科遠(yuǎn)緣雜交研究中的發(fā)現(xiàn),花粉管的生長受阻可能發(fā)生在7個(gè)不同的部分:①花粉在柱頭表面無法萌發(fā);②花粉粒萌發(fā),產(chǎn)生花粉管,但花粉管在柱頭表面發(fā)生異常;③花粉管進(jìn)入花柱道,但在花柱道內(nèi)出現(xiàn)異常;④花粉管無法進(jìn)入子房;⑤花粉管進(jìn)入子房,但不能進(jìn)入珠孔;⑥花粉管進(jìn)入珠孔,但無法進(jìn)入胚囊;⑦花粉管無法在胚囊內(nèi)釋放精子.不同雜交組合中花粉管生長受阻的部位存在種間差異.該研究以映山紅作為母本雜交,各父本花粉都能夠在映山紅柱頭上附著并萌發(fā),并且各父本花粉管基本上都能到達(dá)花柱下部,雖然不同雜交組合花粉管的生長速度、到達(dá)花柱基部的比率及異?；ǚ酃艿谋嚷实却嬖陲@著差異(圖2).個(gè)別組合,如映山紅×馬纓花、映山紅×滇南杜鵑雜交2個(gè)月后子房未見膨大,但在研究中也觀察到有花粉管進(jìn)入胚珠(圖1(14)).解瑋佳等在高山杜鵑與大喇叭杜鵑(R.excellens)雜交時(shí)也有類似發(fā)現(xiàn),即有花粉管進(jìn)入胚囊,但未見子房膨大.花粉管進(jìn)入胚囊,并不一定能夠完成受精作用,可能會(huì)出現(xiàn)胚囊不親和現(xiàn)象,即花粉管進(jìn)入胚囊并釋放出精子,但精子卻不能有效地與雌配子結(jié)合實(shí)現(xiàn)雙受精,這在玉米等作物的遠(yuǎn)緣雜交中也有報(bào)道.在杜鵑雜交研究中發(fā)現(xiàn),花粉管進(jìn)入胚囊后,會(huì)因出現(xiàn)過度生長等情況,而無法完成受精.該研究還發(fā)現(xiàn)部分雜交組合在萌發(fā)初期,或花柱中、上部出現(xiàn)異?；ǚ酃?但在下部恢復(fù)正常,進(jìn)入胚囊.Williams等發(fā)現(xiàn)異常的花粉管也能伸入胚囊,但是否能順利完成受精,還需要進(jìn)行進(jìn)一步胚胎發(fā)育學(xué)研究.錦繡杜鵑作為母本雜交時(shí),僅種內(nèi)及映山紅組內(nèi)雜交72h后,有花粉管進(jìn)入花柱下部(圖3),這幾個(gè)雜交組合也獲得了種子.杜鵑亞屬、馬銀花亞屬以及同一亞屬不同組的大字杜鵑花粉管沒能到達(dá)花柱基部,在花柱通道內(nèi)花粉管的生長受阻,或因其生長速度過慢,在授粉72h后花粉管仍未能達(dá)到花柱底部;并且這些雜交組合中異常花粉管的比率也較高(圖3).這些雜交組合在雜交后均未獲得雜交種子,雖然部分雜交組合,如錦繡杜鵑×大字杜鵑、錦繡杜鵑×睫毛杜鵑等,雜交2個(gè)月后有子房膨大現(xiàn)象,但并未正常發(fā)育,形成種子,這表明這些雜交組合同時(shí)存在受精后障礙.整體來看,雜交親和性較好的組合,花粉管生長速度較快,到