利用微生物法制備核糖核酸rna酵母

利用微生物法制備核糖核酸rna酵母

廢棄的母豬約占啤酒行業(yè)副產(chǎn)品的2.5%，螺母中的鈉含量占干物質(zhì)的6%8%。鈉在制藥行業(yè)、食品行業(yè)和食品行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。它的利用將給企業(yè)帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。核酸存在于一切活細(xì)胞中,是和蛋白質(zhì)相似的生物大分子。核酸不僅是分子生物學(xué)的中心研究問(wèn)題,也是生物化學(xué)的一個(gè)重要分支。酵母核糖核酸存在于從簡(jiǎn)單的逆轉(zhuǎn)錄病毒到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所有生命形式中,它在蛋白質(zhì)生物合成中起重要作用。核糖核酸在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥衛(wèi)生、科學(xué)研究及人們的日常生活中有著越來(lái)越廣泛的重要的作用。核酸研究的首要方法是分離和測(cè)定。核酸制備中共同需要注意的問(wèn)題是防止核酸的的降解和變性,要盡量保持其在生物體內(nèi)的天然形態(tài),要制備天然狀態(tài)的的核酸,必須采用溫和的條件,防止過(guò)酸、過(guò)堿、避免劇烈攪拌,尤其重要的是要防止核酸酶的作用。天然核酸都有生物活性,這是檢驗(yàn)其質(zhì)量的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用堿法和鹽法1材料和方法1.1核糖核酸乙酯酸乙酯類(lèi)酵母:遼寧天湖啤酒廠取來(lái)的鮮酵母試劑:氫氧化鈉,鹽酸,氯化鈉,無(wú)水乙醇,核糖核酸,乙醚。儀器設(shè)備:2XZ-1型旋片式真空泵、JB-3A型定時(shí)恒溫磁力攪拌器、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、DJM50L膠體磨、PHB-4型便攜式pH計(jì)、F-1004分析天平、SPECORD200紫外分光光度計(jì)。1.2rna的提取稀堿法:將10g鮮酵母和少許石英砂加到研缽中,再加入一定量0.04mol·L-1的氫氧化鈉溶液,在研缽中充分研磨(此步是實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵)至少15min,然后將勻漿液轉(zhuǎn)移到大試管中,再用一定量0.04mol·L-1的氫氧化鈉溶液分兩次洗滌研缽,洗滌液并入勻漿液中。在水浴中加熱25min,冷卻后以3000r·min-1離心15min,將上清液小心傾入盛有酸性乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)95%乙醇30mL加0.3mL濃鹽酸混勻)的小燒杯中,一邊攪拌一邊緩緩傾入。待核糖核酸沉淀完全后,3000r·min-1離心3min,棄去上清液,再用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗滌沉淀、離心(同上)兩次即得RNA粗制品。再用乙醚洗兩次通過(guò)布氏漏斗抽濾就可得到RNA粉末。濃鹽法:取濕酵母10g,加入一定量的NaCl和水,控制鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%左右,攪拌均勻,置于95℃水浴鍋中攪拌2h,然后將提取液立即用自來(lái)水冷卻10min,裝入離心管以3500r·min-1離心10min,將所得上清液傾于燒杯中并置于放有冰塊的燒杯中冷卻,待冷卻至10℃下用6mol·L-1鹽酸調(diào)pH至2.4,調(diào)好后于冰水中繼續(xù)靜止10min,使沉淀充分,將所得上清液以3000r·min-1離心10min得核糖核酸沉淀,將沉淀放于小燒杯內(nèi),用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇充分?jǐn)嚢柘礈?可以去除殘余雜質(zhì)及色素,再用乙醚洗兩次通過(guò)布氏漏斗抽濾就可得到RNA粉末。1.3rna含量檢測(cè)采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫外光譜分析。RNA含量測(cè)定:標(biāo)準(zhǔn)RNA母液:準(zhǔn)確稱(chēng)取RNA50.0mg,用少量0.05mol·L-1NaOH溶液濕透,研磨至糊狀的混濁液,加少量蒸餾水混勻,調(diào)pH=7.0,再用蒸餾水定容至50mL,配得溶液RNA質(zhì)量濃度為1mg·L-1。標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液:準(zhǔn)確移取5.00mL標(biāo)準(zhǔn)RNA母液置于容量瓶中定容到50mL,此溶液含RNA質(zhì)量濃度為100mg·L-1。RNA樣品待測(cè)液:控制RNA質(zhì)量濃度在10～100mg·L-1范圍內(nèi),取干燥RNA制品10mg,配制方法同標(biāo)準(zhǔn)RNA母液,定容至100mL,此溶液含RNA粗制品質(zhì)量濃度為100mg·L-1。取一定量的已配制的RNA樣品待測(cè)液,稀釋一倍,在10～100mg·L-1范圍內(nèi)吸光度A與RNA質(zhì)量濃度呈線(xiàn)性關(guān)系,于紫外分光光度計(jì)上測(cè)定260nm光吸收值。計(jì)算RNA質(zhì)量濃度公式為:RNA質(zhì)量濃度(mg·L-1)=A260/(0.024×L)A260為260nm處光吸收值,L為1cm比色皿2結(jié)果與討論2.1濃鹽法提取核糖核糖最佳條件的確定從所查得的資料及所做實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出稀堿法提取核糖核酸的主要影響因素為NaOH濃度、堿裂解煮沸時(shí)間、pH值,最佳實(shí)驗(yàn)條件為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%,堿裂解煮沸時(shí)間25min,pH值為5.5,將在此條件下所做實(shí)驗(yàn)部分?jǐn)?shù)據(jù)列表1及圖1。經(jīng)比較表中的實(shí)驗(yàn)3效果最好得率高。從所查資料及所做實(shí)驗(yàn)得出濃鹽法提取核糖核酸的主要影響因素為鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溶液pH值、升溫速率,最佳實(shí)驗(yàn)條件為鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.0%～11.0%、溶液pH值6.0～7.0、加鹽后溶液溫度迅速升至95℃,盡可能縮短20～70℃之間的停留時(shí)間,減少磷酸二脂酶的降解率。將在此條件下所做實(shí)驗(yàn)部分?jǐn)?shù)據(jù)列表2及圖2。經(jīng)比較表中的實(shí)驗(yàn)4效果最好得率高。2.2堿的濃度和提取溫度從濃鹽法和稀堿法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果上比較,兩種提取方法的結(jié)果有較大差別,提取得率鹽法比堿法高。從酵母中提取核糖核酸,首先要破壞酵母的細(xì)胞壁使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。破壁方法有:物理法(超聲波、勻漿器等)、化學(xué)法(化學(xué)試劑如:去污劑、蛋白質(zhì)變性劑等)、物理化學(xué)法(濃鹽法)、生物法(用溶菌酶)。破壁方法不同,所得結(jié)果也不同。稀堿法是屬化學(xué)破壁法,其方法是在一定堿濃度下,使構(gòu)成細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)、脂肪及糖的化合物得到水解,從而破壞細(xì)胞壁,此法對(duì)堿的濃度及提取溫度要求比較嚴(yán)格,堿的濃度不可過(guò)濃,應(yīng)控制在1%,并且對(duì)提取溫度也有一定的要求,提取時(shí)間短。因?yàn)樵谶^(guò)分劇烈的條件下,容易使核糖核酸分子內(nèi)的酯鍵斷裂,使核糖核酸降解而影響收得率。濃鹽法是屬于物理化學(xué)破壁法,濃鹽法提取核糖核酸是基于改變酵母細(xì)胞的滲透壓,使細(xì)胞自身破裂而釋放出核糖核酸,提取過(guò)程鹽濃度控制在10%左右,提取溫度在90～100℃,提取時(shí)間較長(zhǎng),并且不可在20～70℃停留,因?yàn)樵诖藴囟认聲?huì)引起酵母自身酶降解作用,使核糖核酸降解而影響收得率。從這兩種提取方法比較來(lái)看,稀堿法處理過(guò)程中,對(duì)堿濃度及提取溫度要求比較嚴(yán)格較不容易控制,因此提取得率較低。濃鹽法操作比較簡(jiǎn)單容易控制,因此濃鹽法得率較高。利用鹽法從酒精廢水生產(chǎn)的酵母中提取核糖核酸,工藝簡(jiǎn)單,操作方便,易控制,并且提取得率高,產(chǎn)品質(zhì)量有保證。所以在以后的生產(chǎn)實(shí)踐中可以更廣泛地應(yīng)用鹽法來(lái)提取制備RNA。啤酒廢水污染主要是有機(jī)污染,在生產(chǎn)過(guò)程中,排放出的廢物和廢液(主要是廢酵母和蛋白質(zhì)凝固物)含有一定數(shù)量的碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì),這些廢物多且無(wú)毒,完全