基因芯片技術(shù)介入中藥研究的思考

基因芯片技術(shù)介入中藥研究的思考

隨著遺傳因子時代的開始，基因組學(xué)提供了大量藥物樣本，并重要的是，基因芯象技術(shù)、生物信息技術(shù)和藥物基因組學(xué)等新技術(shù)的發(fā)展帶來了新的技術(shù)?；蛐酒愿咄俊⒍嘁蛩?、微型化和快速靈敏的特點而見長,能夠針對中藥的多成分、多途徑、多系統(tǒng)、多靶點的作用特點而進行系統(tǒng)深入的研究。中藥化學(xué)成分復(fù)雜,有效成分不清且定性定量仍有困難,個體差異大,現(xiàn)代科學(xué)理論的支持不夠?；蛐酒夹g(shù)主要應(yīng)用于基因表達譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變、多態(tài)性分析及監(jiān)測基因組整體轉(zhuǎn)錄表達情況,為探索中藥作用靶點、藥物篩選、中藥成分鑒定、道地藥材鑒別等現(xiàn)代中藥研究開辟了嶄新的領(lǐng)域。中藥化學(xué)組學(xué)建立中藥指紋圖譜分析中藥或復(fù)方的物質(zhì)組成和有效成分,中藥基因組學(xué)則致力于研究復(fù)方制劑的特定基因作用模式。1基因芯片技術(shù)在DNA芯片的表面,以微陣列的方式固定大量(可達10000個/cm)并行的寡核苷酸或cDNA探針,藉此可以對生物體整個基因組的基因表達進行測定,從而確定藥物作用的靶點。人體是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),疾病的發(fā)生和發(fā)展必然牽涉到網(wǎng)絡(luò)中的諸多環(huán)節(jié)。應(yīng)用傳統(tǒng)的基因?qū)ふ也呗匀缇酆厦告湻磻?yīng)(DD-PCR)等雖然為發(fā)現(xiàn)新的功能基因提供了一些線索,但仍有相當?shù)木窒扌浴６鳧NA芯片可以從疾病及藥物兩個角度對生物體的多個參量同時進行研究,以發(fā)掘藥物靶點并同時獲取大量其他相關(guān)信息。因此在這種情況下,任何一元化或相對一元化的分析方法均不及DNA芯片的分析手段更具有優(yōu)勢?；蛐酒夹g(shù)有助于識別藥物相應(yīng)的靶序列,分析整個基因組藥物作用,監(jiān)視藥物治療反應(yīng)中的基因表達改變,并觀察藥效。對于中藥及中藥復(fù)方配伍多靶點作用機制的研究,瞬時、快速、同位置的靶點分析至為重要,但同時進行靶點反應(yīng)的差異性比較一直較為困難?；蛐酒夹g(shù)可以為探索中藥作用機制提供有效的依據(jù)。如陳明偉等利用基因芯片技術(shù)檢測中藥單體人參皂苷20(R)Rg3對腫瘤血管生長調(diào)控因子(VEGF)蛋白表達的抑制作用。張占軍等制作梔子苷治療缺血模型大鼠的基因表達譜芯片顯示差異表達的基因有70條,其中有68條基因上調(diào),2條基因下調(diào)。通過生物信息學(xué)分析得出結(jié)論,梔子苷對局灶性腦缺血大鼠腦組織基因表達具有調(diào)控作用,從分子水平闡釋了中藥清開靈注射液成分梔子苷的藥理作用機制。朱方石等運用云母高、中、低等3種不同劑量的單體顆粒劑,對實驗性萎縮性胃炎大鼠進行了分組干預(yù)治療,采用免疫組織化學(xué)方法的EnVision系統(tǒng)二步法,觀察模型大鼠胃黏膜突變型抑癌基因p53、癌基因p21、抑癌基因p16及細胞凋亡抑制基因bcl2等基因蛋白表達變化情況。結(jié)果顯示3種不同劑量有降低p53,p21表達的傾向,對p16的缺失和bcl22的高表達有明顯調(diào)節(jié)作用,并能減輕胃黏膜炎癥,促進腺體的再生。結(jié)論是云母對萎縮性胃炎的治療和逆轉(zhuǎn)作用可能與對癌相關(guān)基因蛋白表達的調(diào)控作用有關(guān)。這些研究從基因芯片表達的角度探索中藥的分子層面作用機制,為進一步闡明復(fù)方和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。2應(yīng)用長絲件材料進行藥物成分分析,并通過高密度基由于中藥品種繁多,成分復(fù)雜,選擇療效確切、作用機制明確的藥物難度較大?；蛐酒夹g(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展有可能簡化研究的過程和大大降低研究的難度?？梢赃x擇特定的疾病模型。提取其病理情況下的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,建立該疾病的基因芯片,并以此檢測藥物作用后基因的表達差異,從而對單味藥的各種化學(xué)成分或不同的復(fù)方進行篩選和分析,找出確定的有效成分或合適的組方供進一步進行新藥研究。有研究利用寡核苷酸芯片分析抗腫瘤草藥黃連根及其8個組成分子的12600個基因,經(jīng)過生物信息學(xué)處理,最終確定黃連素是黃連抗增殖的效應(yīng)部位,并佐證了DNA芯片用于單味中藥的效應(yīng)部位分析。利用高密度芯片技術(shù)可以從中藥中尋找新的有效成分,是目前一大趨勢。高密度基因芯片可以迅速探知基因組中1萬、10萬甚至50萬SNPs的基因型,從而根據(jù)藥效和藥物毒性等表型對某一成分的有無反應(yīng)進行基因認定,由于不同成分影響不同的基因表達,應(yīng)用表達基因芯片就可以迅速找到有效成分,分析清楚有效成分化學(xué)結(jié)構(gòu),再利用已成熟的化學(xué)合成法即可得到低毒、有效的化學(xué)成分。這條途徑目前已成為新藥開發(fā)的一個優(yōu)選途徑,而利用高密度芯片技術(shù)則是實現(xiàn)該途徑的一個非常有效的手段,在成分的篩選上有著巨大的優(yōu)勢。3采用基因芯片進行鑒定基因芯片用于中藥品種的快速、準確、自動化鑒別,已有不少進展。這一技術(shù)的前提是獲取不同中藥樣本的特異性基因序列,即基因分型。現(xiàn)在常用的基因分型方法有直接測序熒光能量轉(zhuǎn)移探測、動力及熒光偏振等。研究者找出某種中藥品種的特定基因或DNA序列后,將這些特定序列作為探針固定于玻片上,制成基因芯片。當一個來自植物或動物的中藥樣本中,含有可以與之互補的特定基因片段時,基因芯片即可以將其測試出來。如果在單片芯片上固定了足夠多的來自不同中藥樣本的特有基因序列,則此種芯片就可以用于多種中藥樣本的鑒別,使分析時間大大減少,極大的提高了鑒定效率。如ZhangYB等用基因芯片技術(shù)對中藥復(fù)方中單味藥材石斛的不同種屬進行了鑒別研究,將16個不同種屬石斛的ITS1-5.8S-ITS2序列固定于玻片上制作了基因芯片,并用熒光標記的ITS2序列作為探針,可檢測出5種已被載入《中國藥典》的石斛。TSOIPui-yan用PCR擴增法和DNA直接測序法確定核苷酸多態(tài)性,用DNA芯片進行基因檢測。他首先提取來自多種貝母根莖的基因組DNA,對26SrDNA基因D2與D3區(qū)的多態(tài)性片段進行擴增和測序,然后將不同種屬多態(tài)性片段的特異性寡核苷探針點置于經(jīng)多聚賴氨酸處理包被的芯片。用來自不同種貝母的熒光素標記的PCR產(chǎn)物與DNA芯片進行雜交,在芯片特定位置檢測到不同種貝母的熒光信號,為植物種屬的驗證與質(zhì)量控制提供一種快速、高通量的檢測工具。雖然基因序列分析已成功地用于貝母、黃芪、人參、川芎、龜甲、鱉甲等鑒別,但目前對中藥的特征DNA序列知之甚少。遠不能滿足基因序列分析鑒定中藥的要求。要實現(xiàn)基因芯片技術(shù)鑒定中藥,必須全面研究中藥的基因組特征,實現(xiàn)藥材真?zhèn)舞b別系統(tǒng)基因庫標準基因圖譜的建立。4高效、高通量生物信息檢測技術(shù)道地藥材除了與其特定的生長環(huán)境和特殊的采收加工有關(guān)外,最重要的還與其產(chǎn)區(qū)內(nèi)這一物種的地方種群的遺傳性狀有關(guān)。而這種遺傳特性的差異,造成道地藥材與非道地藥材品質(zhì)的差異,但道地藥材與非道地藥材為同種異地生物,兩者形態(tài)、組織構(gòu)造等特征的差別往往不明顯,給道地藥材的鑒別帶來很大困難。而利用基因芯片高效、高通量分析生物信息的優(yōu)勢可快速進行鑒別。這種鑒別芯片可以采用密度較低,集PCR、雜交、檢測于一體的PCR芯片。這類芯片成本低,應(yīng)用廣泛,可推廣到各地中藥材站、醫(yī)院的藥材科、海關(guān)以及眾多的中藥科研機構(gòu)。同時研究道地藥材的基因組特征,最終實現(xiàn)道地藥材真?zhèn)舞b別系統(tǒng)及優(yōu)良種系基因庫標準基因圖譜的建立,特別是對有效成分的研究,可為新藥的研究提供先導(dǎo)化合物;對功能基因組順序結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機制的闡明,能夠提高有效物質(zhì)的產(chǎn)量和減除有害成分;還可用于轉(zhuǎn)基因中藥材的構(gòu)建和解決瀕危中藥材的可持續(xù)應(yīng)用。章群運用PCR產(chǎn)物直接測序法測定杜仲原植物matK基因序列,通過Clustal軟件將其與GenBank中同源序列進行排序比較,發(fā)現(xiàn)32個特異性位點,其中特異性A,T,C,G位點分別為8,2,11,11,序列中有一個GAC插入為杜仲所獨有,結(jié)論認為matK基因序列的測序分析可成為杜仲正品鑒定的有效手段。5中藥新出路的建立在藥物研發(fā)項目中,啟動篩選并發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物之后的首要任務(wù)是從臨床化學(xué)家合成的眾多化合物中優(yōu)選出臨床候選分子。盡管基因組學(xué)或蛋白組學(xué)水平的表達譜永遠不可能完全取代動物或者細胞模型等傳統(tǒng)試驗,但其卓越的效力差異評估和全面的技術(shù)模式有望在將來提高所選擇化合物最終成為新藥的可能性,比傳統(tǒng)的動物實驗更快地實現(xiàn)這個目標,這是藥物組學(xué)的新藥篩選趨勢。目前中藥新藥的篩選方法汲取了現(xiàn)代藥物基因組學(xué)的思路方法,但未真正體現(xiàn)中藥對病因、癥狀、并發(fā)癥多靶點作用的特點,這同樣也成為制約中藥現(xiàn)代化的另一個瓶頸。篩選雖不是發(fā)現(xiàn)中藥新藥的惟一途徑,但對創(chuàng)新藥物來講,篩選是必不可少的手段和途徑。將中藥材進行分類、鑒定,并經(jīng)過粗提、色譜等方法分離成各種成分,然后通過核磁、質(zhì)譜等方法確定其化學(xué)性質(zhì),最后將所有數(shù)據(jù)輸入已經(jīng)構(gòu)建的天然化合物數(shù)據(jù)庫。這樣建立的天然化合物庫具有多樣化、標準化和系統(tǒng)性等特點。然后通過初篩、復(fù)篩得到活性化合物,深入篩選得到相應(yīng)的先導(dǎo)化合物,進而在進行確證篩選得到候選藥物(圖1)。有學(xué)者提出了現(xiàn)代中藥新藥篩選系統(tǒng),該系統(tǒng)建立有對照的有效部位差異基因表達譜數(shù)據(jù)庫,可在基因表達水平上更快速、更準確、更為可行地進行中藥單、復(fù)方、中藥之間的配伍、中藥各組分之間的配伍篩選,大大縮短新藥研究的周期。在進行高通量篩選中,其局限性如假陽性和化合物樣品問題,將是下一步解決的問題。6中藥基因組學(xué)與環(huán)中學(xué)學(xué)研究的系統(tǒng)性問基于迅猛發(fā)展中的基因芯片技術(shù)平臺形成的現(xiàn)代中藥研究(圖2),呈現(xiàn)出比較成熟的研究輪廓,從基因組測序、ESTs測序、藥用活性成分生物相關(guān)基因研究,到復(fù)方組分的系統(tǒng)生物學(xué)研究,都融合了功能基因組、蛋白組、化學(xué)生物學(xué)研究的新方法、新技術(shù),中醫(yī)藥學(xué)強調(diào)綜合療效、治標治