高糖誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞il-6、nf-mrna表達(dá)及對(duì)糖尿病腎病的影響

高糖誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞il-6、nf-mrna表達(dá)及對(duì)糖尿病腎病的影響

糖尿病性腎衰竭（dn）是腎衰竭的主要原因之一。研究表明炎癥機(jī)制尤其是一些炎癥因子過表達(dá)是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,DN的發(fā)病過程無免疫機(jī)制參與,但近期有較多研究涉及DN與補(bǔ)體的關(guān)系。有報(bào)道在糖尿病及DN患者腎臟和尿液中檢測(cè)到高濃度的補(bǔ)體激活終產(chǎn)物——膜攻擊復(fù)合物(membraneattackcomplex,MAC),提示DN的發(fā)病可能涉及補(bǔ)體激活機(jī)制。此外,研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型體內(nèi)存在甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannosebindinglectin,MBL)水平的明顯升高,且與患者的死亡率呈正相關(guān)。基于以上研究,我們?cè)O(shè)想在DN患者體內(nèi)可能存在MBL途徑補(bǔ)體激活。補(bǔ)體激活的終末產(chǎn)物MAC可引起炎癥因子表達(dá)增加。因此,如能檢測(cè)到在高糖刺激下內(nèi)皮細(xì)胞表面有MBL和MAC的沉積以及細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的升高,將證明DN的發(fā)病中MBL補(bǔ)體激活機(jī)制的存在,并可將其與DN的炎癥機(jī)制聯(lián)系起來。1材料和方法1.1免疫酶n,b人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(HRGEC)、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(美國ScienCell);重組人MBL、人白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒、人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(美國R&D);TrizolReagent、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen);BrilliantSYBRGreenmastermix(日本Toyobo);FITC標(biāo)記的鼠抗人C3單克隆抗體(美國BioSciences);生物素化的鼠抗人MBL單克隆抗體(美國HycultBiotechnology);Streptavidin-PE/Cy5(美國Biolegend);鼠抗人MAC單克隆抗體(美國SantaCruz);FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(美國DAKO);EXL808全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK)、ABI7500熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國ABI);EPICS—XLⅡ型流式細(xì)胞儀(美國Beckman-Coulter);熒光顯微鏡(日本Olympus);IL-6、TNF-α、內(nèi)參GAPDH引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。1.2糖刺激對(duì)hrcg有影響1.2.1濃度接種入孔細(xì)胞按常規(guī)方法復(fù)蘇后,加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng),選取第4~6代細(xì)胞,按照105/mL濃度接種入6孔板中,每孔2mL。分為3組:正常糖組(5mmol/LD-葡萄糖)、甘露醇組(5mmol/LD-葡萄糖+25mmol/L甘露醇)和高糖組(30mmol/LD-葡萄糖),每組設(shè)3復(fù)孔。置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后,離心分離上清液和細(xì)胞,上清液用于ELISA檢測(cè),細(xì)胞用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR)檢測(cè)。1.2.3方法的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá),操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,檢測(cè)IL-6時(shí)樣品稀釋10倍效果最佳,而檢測(cè)TNF-α?xí)r樣品無需稀釋。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀450nm波長處檢測(cè)各組吸光度(A)值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3通過補(bǔ)體激活對(duì)高糖刺激和高血糖刺激的影響1.3.1制備人血清正常人血清中含一定濃度的MBL,為排除這部分MBL的影響,保持各組實(shí)驗(yàn)條件的一致性,必須制備MBL缺乏的人血清。制備方法按照文獻(xiàn),采用親和色譜法將甘露聚糖交聯(lián)到瓊脂糖(Sigma公司),產(chǎn)物用含有Mg2+Ca2+Hanks(HBSS)。1.3.3熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)完畢后消化制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整密度至1×106/mL。加入生物素化的鼠抗人MBL單克隆抗體(0.45μg/106個(gè)細(xì)胞)及FITC熒光標(biāo)記的鼠抗人C3單克隆抗體(0.2μg/106個(gè)細(xì)胞),室溫避光孵育30min;PBS洗滌2次,1500r/min離心,加入Streptavidin-PE/Cy5,室溫避光孵育30min;PBS洗滌1次,1500r/min離心,重懸細(xì)胞于300μLPBS中上機(jī)檢測(cè)。設(shè)本底對(duì)照和陰性對(duì)照。檢測(cè)前以雞血紅細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器變異系數(shù)(CV)值在2%以內(nèi)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3.4溫室模擬培養(yǎng)制備細(xì)胞爬片,冷丙酮固定20min。加入鼠抗人MAC單克隆抗體(1∶50)室溫避光孵育1h;洗滌后加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶70),室溫避光孵育45min,洗滌,固定液覆蓋固定10min,免疫熒光封存液、蓋玻片封片,熒光顯微鏡下觀察照相。1.3.5il-6和tnfmrna和蛋白質(zhì)檢測(cè)1.4方差分析和q檢驗(yàn)計(jì)量資料以x±s表示。1.2部分各指標(biāo)的組間比較采用方差分析和q檢驗(yàn),1.3部分各指標(biāo)的組間比較,方差齊時(shí)采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn),不齊時(shí)行數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)變換(X=lgX)使其方差齊。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1高糖組與對(duì)照組il-6和tnf-mrna表達(dá)比較高糖組IL-6和TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為正常糖組的1.77倍和2.23倍。高糖組與其余兩組相比,IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘露醇組與正常糖組相比,IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。2.2高糖組與其他兩組il-6和tnf-蛋白表達(dá)的比較ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-6和TNF-α蛋白濃度,高糖組與其余兩組相比,IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘露醇組與正常糖組相比,IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。2.3不同高糖組不同部位mbl和c3沉積陽性率的比較經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè),高糖+MBL組MBL和C3共沉積的陽性率為6.1%,C3沉積陽性率為8.5%。而單純高糖組MBL和C3共沉積陽性率為0,也無明顯C3沉積。其余兩次檢測(cè)結(jié)果類似(共沉積陽性率兩組分別為5.3%,0.1%;6.0%,0)。見圖1。2.4mac細(xì)胞表面免疫熒光染色可見高糖+MBL組細(xì)胞膜上有明顯黃綠色MAC熒光復(fù)合物沉積,單純高糖組未觀察到明顯熒光信號(hào)。見圖2。2.5通過補(bǔ)體激活對(duì)高糖刺激il-6和tnf-i的影響3補(bǔ)體機(jī)制與炎癥機(jī)制的上下游關(guān)系DN是糖尿病的重要微血管并發(fā)癥,腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與之密切相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞在小球固有細(xì)胞中所占比例最大,糖尿病早期即可受累。慢性低度炎癥在DN發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其中某些炎癥因子的過表達(dá)是極重要的機(jī)制。對(duì)體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究表明,高糖可以誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等炎癥因子的過表達(dá),但國內(nèi)外少見可以直接顯示腎臟受累的關(guān)于HRGEC的研究。本研究利用高糖培養(yǎng)的HRGEC的結(jié)果顯示,高糖可使細(xì)胞IL-6、TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)明顯增加,直接在HRGEC證實(shí)了高糖對(duì)炎癥因子表達(dá)的誘導(dǎo)作用。IL-6是炎癥介導(dǎo)DN的重要因子,在1、2型糖尿病患者,尤其是有腎損害患者的血清和組織中濃度明顯增加,且隨腎病的嚴(yán)重程度而升高。TNF-α在DN患者的血清、尿液及外周血單核細(xì)胞中均有升高,且與1型糖尿病患者的腎小球?yàn)V過率(GFR)密切相關(guān),可增加腎小球血管通透性,刺激血管外基質(zhì)過量產(chǎn)生和內(nèi)皮細(xì)胞增殖,在糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明,高糖可以造成小球局部炎癥狀態(tài),促進(jìn)DN進(jìn)展,這為加強(qiáng)血糖控制治療提供了更多的依據(jù)。近年來DN的發(fā)病機(jī)制研究又有了新發(fā)展。多項(xiàng)大規(guī)模臨床研究證實(shí),MBL補(bǔ)體途徑與DN之間存在密切聯(lián)系。在1、2型糖尿病及DN患者中均發(fā)現(xiàn)MBL明顯升高,且與疾病的嚴(yán)重性呈正相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明,MBL基因敲除可以減輕糖尿病動(dòng)物模型的腎功能損害和形態(tài)學(xué)改變,腎臟損害與MBL有關(guān)。補(bǔ)體激活過程中,補(bǔ)體成分首先沉積在其攻擊物的表面,再發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察到MBL刺激下高糖培養(yǎng)的HRGEC表面MBL補(bǔ)體途徑的啟動(dòng)物質(zhì)MBL和中間反應(yīng)物C3的明顯共沉積,顯示已經(jīng)發(fā)動(dòng)MBL補(bǔ)體激活進(jìn)程。用免疫熒光技術(shù)觀察到細(xì)胞表面黃綠色補(bǔ)體激活產(chǎn)物MAC的明顯沉積,表明高糖刺激下MBL和C3共沉積后,有MAC的裝配形成和沉積。這樣就從整個(gè)MBL補(bǔ)體激活途徑的3個(gè)關(guān)鍵部位證實(shí)了高糖+MBL組MBL途徑補(bǔ)體激活的存在,而單純高糖組無此現(xiàn)象。MAC具有細(xì)胞毒和促炎作用,可以介導(dǎo)炎癥因子表達(dá)增加和糖尿病患者慢性炎癥狀態(tài)的發(fā)生。MAC插入細(xì)胞可引起一系列炎癥因子釋放,如TGF-β、TNF-α和白細(xì)胞介素等;還可刺激氧自由基,促使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑啟動(dòng),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高糖+MBL組與單純高糖組相比,IL-6、TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)均增加。IL-6與TNF-α均是炎癥介導(dǎo)DN的重要因子?？傊?高糖與MBL共存時(shí),MBL可以在內(nèi)皮細(xì)胞表面沉積,激活補(bǔ)體,形成MAC,導(dǎo)致炎癥因子釋放。這樣就將補(bǔ)體機(jī)制與DN炎癥機(jī)制聯(lián)系起來,并證明二者之間存在一定上下游關(guān)系。綜上,本研究證實(shí)了高糖對(duì)HRGEC表達(dá)炎癥因子的誘導(dǎo)作用并首次在體外培養(yǎng)的HRGEC中證實(shí)MBL途徑補(bǔ)體激活機(jī)制對(duì)DN的致病作用,并證明補(bǔ)體機(jī)制與炎癥機(jī)制之間存在一定上下游關(guān)系。補(bǔ)體激活等免疫因素參與糖尿病微血管病變的機(jī)制一旦被更多的實(shí)驗(yàn)室和臨床證據(jù)證實(shí),必將為DN的防治提供嶄新的策略。1.2.2pcr擴(kuò)增參數(shù)收集細(xì)胞,Trizol法提取總RNA,取1μg按試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real-timePCR反應(yīng)總體系為25μL,包括:13μL1×SYBRMix,1μLPCR上游引物(0.2μmol/L),1μLPCR下游引物(0.2μmol/L),7.5μLddH2O,2.5μLcDNA。以GAPDH為內(nèi)參照。PCR擴(kuò)增參數(shù):95℃預(yù)變性10min;45個(gè)循環(huán):95℃變性15s,63℃退火10s、延伸17s實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR完成后,在ABIPrismSDS2.0軟件上進(jìn)行自動(dòng)分析,查看每個(gè)基因的擴(kuò)增情況,導(dǎo)出相應(yīng)的循環(huán)域值(Ct),校正cDNA模板的細(xì)胞拷貝數(shù),計(jì)算相對(duì)量采用2-ΔΔCt法,ΔΔCt=[CtGI(未知樣品)-CtGAPDH(未知樣品)]-[CtGI(校正樣品)-CtGAPDH(校正樣品)],平均相對(duì)含量(RQ)=2-averageΔΔCt×100%。1.3.2il-6和tnf-mrna表達(dá)量檢測(cè)預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們采用流式細(xì)胞技術(shù)證實(shí),高糖(30mmol/L)培養(yǎng)HRGEC24h后加入1μg/mLMBL作用4h左右細(xì)胞表面MBL和C3的沉積達(dá)峰值。取內(nèi)皮細(xì)胞,按105/mL濃度接種入6孔板中,每孔