抗腫瘤藥物的篩選與篩選

抗腫瘤藥物的篩選與篩選

腫瘤是一種常見(jiàn)的疾病，嚴(yán)重威脅著人類的生活質(zhì)量。他被稱為人類健康的第一殺手。多年來(lái)人類一直在不斷的進(jìn)行抗腫瘤藥物的研究,抗腫瘤藥物的篩選是整個(gè)研究過(guò)程中很重要的一個(gè)環(huán)節(jié),而進(jìn)行藥物的篩選首先離不開(kāi)合理的篩選方法和系統(tǒng)。尋找選擇性強(qiáng)﹑對(duì)實(shí)體瘤有效的新型抗腫瘤藥物,是擺在抗腫瘤藥物研究人員面前的重要任務(wù)。世界各國(guó)對(duì)抗腫瘤藥物的篩選都非常重視,投入了大量的人力﹑物力﹑財(cái)力,每年都有大量的化合物(合成藥﹑天然產(chǎn)物和微生物發(fā)酵產(chǎn)物)待篩,抗腫瘤藥物篩選方法的發(fā)展經(jīng)歷了一個(gè)探索的過(guò)程。80年代中期以前,普遍采用的篩選方法是以體內(nèi)小鼠白血病/淋巴瘤模型P388和L1210為基礎(chǔ)的,所有化合物在進(jìn)一步的臨床研究之前必須通過(guò)這種小鼠腫瘤模型的篩選。即小鼠白血病P388和L1210作為第一輪初篩,能通過(guò)第一輪初篩的化合物才能被允許進(jìn)入第二輪篩選。這種方法有一個(gè)很明顯的缺陷就是一些在臨床上有活性的藥物將被篩選掉,無(wú)法保證所有具有抗腫瘤作用的藥物都能通過(guò)篩選。鑒于以前的篩選方法存在較大的缺陷,1985年之后以NCI為首的一些研究單位普遍開(kāi)始采用針對(duì)疾病的篩選方法來(lái)代替針對(duì)化合物的篩選方法,即放棄體內(nèi)小鼠篩選,代之為體外代表各種常見(jiàn)實(shí)體瘤的人類腫瘤細(xì)胞株篩選。這種篩選系統(tǒng)是一種高通量的抗腫瘤篩選體系,其主要優(yōu)勢(shì)有兩點(diǎn):其一是多種細(xì)胞株初篩有可能篩選出對(duì)特殊的人類腫瘤或?qū)μ厥饨M織亞型有活性的物質(zhì);其二是這種體外篩選尤其適合于復(fù)雜天然產(chǎn)物提取物中有效成份的證實(shí),過(guò)去動(dòng)物篩選需較大量的天然產(chǎn)物,而現(xiàn)在天然產(chǎn)物的需要量就大大減少,可以指導(dǎo)有效成份的進(jìn)一步分離純化,使得從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物更加便利。下面對(duì)現(xiàn)階段較為普遍采用的一些抗腫瘤藥物的篩選方法做進(jìn)一步的闡述。1端粒酶活性的檢測(cè)端粒是染色體特殊結(jié)構(gòu),起著保護(hù)染色體的完整和穩(wěn)定性的作用,端粒酶是一種核糖核蛋白返轉(zhuǎn)錄酶,由RNA和蛋白質(zhì)組成,可以以自身的RNA為模板合成端粒末端。已發(fā)現(xiàn)在正常的體細(xì)胞和良性腫瘤組織中端粒酶活性是陰性,而在人體惡性腫瘤組織和人的腫瘤細(xì)胞株中都表達(dá)了很高的活性。因此,認(rèn)為端粒酶與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系,有可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。為了準(zhǔn)確測(cè)定端粒酶的活性,現(xiàn)普遍采用端粒重復(fù)擴(kuò)增法(telomericrepeatamplify-caionprotocol,簡(jiǎn)稱TRAP)參照Kim等人方法,但有部分改進(jìn)。具體方法如下所述。1.1pcr擴(kuò)增pcr取細(xì)胞酶提取液1μL分別加入TS引物0.36μmol/L,dNTP50μmol,TaqDNA多聚酶1IU,CX引物0.28μmol/L,Mg2+1.5mmol,在25μL反應(yīng)液中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)樵?0℃反應(yīng)30min,72℃30s,然后在94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。1.2聚丙烯酸凝膠電泳分析和開(kāi)發(fā)區(qū)用12%丙烯酰胺灌膠,膠聚合后,取擴(kuò)增產(chǎn)物1025微升加入加樣孔,以180V的電壓進(jìn)行電泳2h左右。1.3顯色凝膠的制備用10%乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝膠35min,然后加入硝酸銀溶液(最終濃度為0.2%),在37℃水浴上振蕩染5min,用超純水洗滌三次。再加入顯色液(30%的NaOH和0.1%的甲醛)振蕩直至DNA條帶出現(xiàn),一般為20min。最后將顯色凝膠移至固定液中固定5min。普通光源照像。1.4端粒酶活性的判斷由于端粒是由短DNA重復(fù)序列組成,而端粒酶的作用是維持端粒末端的長(zhǎng)度,因此可以用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物間接反映端粒酶活性。即在DNA條帶中顯示出6bp的梯狀條帶,則判斷端粒酶的活性依然存在為陽(yáng)性。惡性腫瘤治療的理想靶點(diǎn)應(yīng)該是尋找到一種對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所必須,但又不存在于正常細(xì)胞的物質(zhì)。端粒酶就是一種在許多腫瘤組織中處于高表達(dá)活性,而在正常組織中卻沒(méi)有酶活性表達(dá)的特殊核糖核蛋白物質(zhì)(除生殖和造血干細(xì)胞外)。它在維持腫瘤細(xì)胞的高度增殖時(shí),對(duì)端粒的縮短起著重要的作用,從而提示端粒酶可能是惡性腫瘤組織的一個(gè)標(biāo)志。2活細(xì)胞的檢測(cè)快速熒光素測(cè)定法是一種近幾年發(fā)展起來(lái)的應(yīng)用非常廣泛的體外藥物敏感性測(cè)定方法,其原理為采用一些特殊的熒光染料,對(duì)細(xì)胞的特定成份進(jìn)行染色或標(biāo)記?；蛲ㄟ^(guò)細(xì)胞酶的作用使無(wú)熒光性的材料分解或轉(zhuǎn)換為熒光材料,通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度從而測(cè)定出活細(xì)胞的量。現(xiàn)在普遍采用一種特殊的熒光染料FDA(Fluoresceindiacetate),在正常情況下它不具有熒光,但當(dāng)它加入到具有完整細(xì)胞膜的腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)液中時(shí),由于細(xì)胞分泌的水解酶的作用,FDA水解釋放出具有強(qiáng)烈熒光的熒光素。死亡的細(xì)胞由于其機(jī)能已受到抑制或破壞,FDA水解水平大大降低,這樣通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中熒光的強(qiáng)度,就能測(cè)定活細(xì)胞的數(shù)量,從而測(cè)定出藥物對(duì)細(xì)胞的作用,推測(cè)其抗腫瘤的效果。2.1細(xì)胞不加藥物該實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的不同種腫瘤細(xì)胞系,經(jīng)0.25%胰酶加0.02%EDTA消化后吹打,600-800rpm離心,稀釋至細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。每組3-4個(gè)平行孔,接種在微孔培養(yǎng)板中,對(duì)照組只加細(xì)胞不加藥物。37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。2.2終濃度0.0.0.5.4%常規(guī)傳代細(xì)胞待貼壁后,每孔加藥,使藥液終濃度為0.1ug/mL,0.5ug/mL,1ug/mL,5ug/mL,10ug/mL,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至最佳作用時(shí)間。2.3熒光強(qiáng)度測(cè)定培養(yǎng)至最佳作用時(shí)間的細(xì)胞移去培養(yǎng)液,用PBS緩沖液沖洗兩遍,準(zhǔn)確加入1.8mL/孔PBS緩沖液,隨后加入200uL/孔含F(xiàn)DA的DMSO儲(chǔ)備液(100ug/mL),使其終濃度為10ug/mL,搖勻后,37℃5%CO2條件下培養(yǎng)1h,用熒光分光光度儀RF-540在激發(fā)光波長(zhǎng)為485nm,發(fā)散光波長(zhǎng)為538nm,狹縫為2nm,衰減為5(×16)的條件下測(cè)定每孔溶液的熒光強(qiáng)度值。熒光素測(cè)定法具有快速﹑靈敏﹑準(zhǔn)確性高﹑重現(xiàn)性好的特點(diǎn),其細(xì)胞測(cè)定范圍寬﹑線性好,適用于大量抗腫瘤藥物的篩選和臨床抗腫瘤藥物的預(yù)試。3結(jié)晶紫染色法結(jié)晶紫染色測(cè)定法是由Gillies等于1986年提出來(lái)的一種單層細(xì)胞培養(yǎng)的體外藥物敏感性測(cè)定方法。其原理是結(jié)晶紫染色可通過(guò)細(xì)胞的特定攝生法而選擇性地被細(xì)胞核吸收,死亡的細(xì)胞幾乎不吸收結(jié)晶紫染料。而被核(DNA)吸收的結(jié)晶紫又可為有機(jī)溶媒提取,通過(guò)測(cè)定提取液的光密度值(OD),就可測(cè)定活細(xì)胞的數(shù)量。近幾年經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn),結(jié)晶紫染色法已能適用于大量抗腫瘤藥物的藥敏測(cè)定,具有靈敏度高﹑重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法如下。3.1細(xì)胞不加量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)細(xì)胞系,經(jīng)0.25%胰酶加0.02%EDTA消化后吹打,600-800rpm離心,稀釋至細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。每組4個(gè)平行孔,接種在微孔培養(yǎng)板上?？瞻卓字患訝I(yíng)養(yǎng)液不加細(xì)胞,對(duì)照孔只加細(xì)胞不加藥物。37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。3.2濃度為0.0.0.5%的情況常規(guī)傳代細(xì)胞待貼壁后,每孔加藥液,使藥液終濃度為0.1μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL,5μg/mL,10μg/mL等。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)至最佳作用時(shí)間。3.3結(jié)晶紫的提取至最佳作用時(shí)間的細(xì)胞用11%的戊二醛固定,搖20min,使細(xì)胞停止生長(zhǎng),達(dá)到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均一性。固定后的細(xì)胞用去離子水洗滌至戊二醛液洗凈。37℃烘干。加入0.1%的結(jié)晶紫液對(duì)細(xì)胞染色。振搖30min,用蒸餾水洗滌,至剩余的結(jié)晶紫液沖洗干凈。37℃烘干。加入10%的乙酸對(duì)細(xì)胞吸收的結(jié)晶紫進(jìn)行提取,1h后在波長(zhǎng)為595nm處測(cè)定。結(jié)晶紫染色測(cè)定法具有快速﹑靈敏﹑準(zhǔn)確性高﹑重現(xiàn)性好的特點(diǎn),是一種較好的抗腫瘤藥物的篩選方法。4誘導(dǎo)噬菌體—應(yīng)用噬菌體篩選抗腫瘤藥物已確證多種病毒能引起動(dòng)物腫瘤,噬菌體是細(xì)菌的病毒,與腫瘤病毒相似,噬菌體的DNA也可整合到細(xì)菌染色體上,隨細(xì)菌DNA復(fù)制分裂并傳至子代細(xì)菌,不引起細(xì)菌裂解但可引起細(xì)菌部分生物學(xué)性狀發(fā)生改變。有些物質(zhì)可使前噬菌體DNA從溶原性細(xì)菌染色體上脫落,復(fù)制合成并釋放出完整的噬菌體,致使敏感的細(xì)菌感染裂解,這種作用稱為誘導(dǎo)作用。有些有誘導(dǎo)作用的物質(zhì)常同時(shí)具有抗腫瘤作用,因此在研究腫瘤病毒—腫瘤細(xì)胞間關(guān)系時(shí),常與溶原性噬菌體—溶原性細(xì)菌模型相比擬,同時(shí)啟發(fā)人們用“誘導(dǎo)噬菌體作用”篩選抗腫瘤藥物,并且已經(jīng)取得一定成效。實(shí)驗(yàn)方法(雙層瓊脂平板—紙片法)如下:(1)用pH7.4之2%固體瓊脂傾注于平皿底部,厚為2mm,凝固后待用。(2)取100mlpH7.4之0.7%半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂,溶化后冷卻至50℃,加入培養(yǎng)18h并已稀釋10-4之金色葡萄球菌75培養(yǎng)液4mL及培養(yǎng)18h未稀釋之金色葡萄球菌47培養(yǎng)液4mL,混勻后,傾入平板上層,厚約1mm。(3)上層瓊脂凝固后,用6mm直徑之無(wú)菌圓形濾紙片1片,沾取待篩藥物浸膏貼于平板上,另以爭(zhēng)光霉素為陽(yáng)性對(duì)照,于37℃中培養(yǎng)。(4)24h后觀察結(jié)果,陽(yáng)性結(jié)果:溶原性細(xì)菌釋放多量成熟的嗜菌體,侵入指示菌體內(nèi)繁殖,而使指示菌裂解,在濾紙片周圍出現(xiàn)密集之噬斑。陰性結(jié)果:濾紙片周圍與背景相同。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明,具有誘導(dǎo)噬菌體作用的藥物大多具有抗腫瘤作用,且用噬菌體—細(xì)菌間特性建立的篩選模型具有簡(jiǎn)便﹑迅速﹑適宜大量藥品篩選的特點(diǎn),可以廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的篩選。5阻斷致瘤病毒復(fù)制腫瘤的發(fā)生是一種多步驟﹑多因素作用的疾病,其中病毒是腫瘤發(fā)生重要的環(huán)境因素之一。目前已明確許多病毒與人類惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān),這些病毒基因在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制﹑表達(dá)﹑通過(guò)多種不同的途徑,導(dǎo)致細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化,引起腫瘤的發(fā)生。隨著病毒致瘤的機(jī)制逐漸被闡明,阻斷致瘤病毒復(fù)制將成為抗腫瘤藥物篩選的基本策略之一。可以通過(guò)對(duì)以下機(jī)理的了解,來(lái)篩選抗腫瘤藥物。5.1阻止病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合和融合病毒感染的最初步驟就是病毒顆粒吸附于靶細(xì)胞,并通過(guò)與靶細(xì)胞受體結(jié)合而與靶細(xì)胞融合形成合胞體,抗體和疫苗可以阻斷病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合。5.2類藥物抑制病毒復(fù)制病毒進(jìn)入細(xì)胞后,DNA的復(fù)制需要核苷類化合物,應(yīng)用核苷類藥物不僅可以抑制病毒復(fù)制的酶,而且可以競(jìng)爭(zhēng)性地進(jìn)入細(xì)胞后磷酸化,滲合到病毒復(fù)制的DNA中,阻斷DNA鏈的延長(zhǎng),抑制病毒復(fù)制。這方面的藥物包括核苷類和開(kāi)環(huán)核苷類。5.3抑制病毒復(fù)制的酶(1)抑制imp脫氫酶次黃嘌呤核苷酸脫氫酶是嘌呤單核苷酸生物合成的關(guān)鍵酶,負(fù)責(zé)將IMP轉(zhuǎn)換成黃嘌呤核苷酸,并進(jìn)一步形成GMP,GDP和GTP以及從GDP經(jīng)dGDP到dGTP,抑制IMP脫氫酶可以影響RNA和DNA的合成。雖然IMP脫氫酶被認(rèn)為是細(xì)胞的靶標(biāo),但是這樣的合成在病毒感染的細(xì)胞中,需求量將增大。因此IMP脫氫酶的抑制被認(rèn)為主要是影響病毒RNA和/或DNA的合成。(2)抑制反向轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶是一種依賴RNA的DNA聚合酶,一些致瘤性病毒就是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA作為模板合成DNA,設(shè)法阻斷這一過(guò)程可阻斷病毒復(fù)制。(3)蛋白水解顆粒的制備蛋白酶是一種催化肽鏈水解的酶,由于病毒表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白和酶是一類大的多聚蛋白體可裝配成傳染性的子代病毒,必須依賴蛋白酶對(duì)多聚蛋白體進(jìn)行水解,如果病毒蛋白酶被抑制則不能裝配成具傳染性的顆粒。以上所述都是一些阻止病毒復(fù)制的方法,而病毒與惡性腫瘤的生成有著密切的關(guān)系,有效的阻止病毒的復(fù)制往往就能使惡性腫瘤的發(fā)生率大大降低,因此正確判斷一種藥物是否具有阻止病毒復(fù)制的功能是進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選的一個(gè)重要方面。6關(guān)于實(shí)現(xiàn)中藥作用的方法我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)藥在腫瘤的治療方面有其獨(dú)特的理論,天然中藥以其療效廣泛﹑確切﹑毒性低受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。近年來(lái),從中藥中提取抗腫瘤有效成份日益得到人們的重視,因此確立一套篩選抗腫瘤中藥有效成份的方法也就越來(lái)越有必要了。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的摸索,除以上所述的幾種方法外,對(duì)具有抗腫瘤作用中藥的篩選己形成了一套具有自身特點(diǎn)的方法,現(xiàn)在一般采取的方法是選取幾種腫瘤細(xì)胞系,以培養(yǎng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?用MTT實(shí)驗(yàn)﹑軟瓊脂等方法,在細(xì)胞水平檢測(cè)中藥提取物或單體的體外抗腫瘤作用,篩選出能夠以較低濃度抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的藥物。在此基礎(chǔ)上,以荷瘤小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在動(dòng)物水平檢測(cè)其在體抑瘤作用。具體方法如下:6.1細(xì)胞水平的選擇(1)dmso處理細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞用含10%熱滅活的小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃,5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。藥物處理將中藥單體或提取物分別溶于DMSO,作用于培養(yǎng)細(xì)胞體系。藥物濃度在0.005至0.5(mg/mL)之間,等量DMSO作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)體系中溶劑濃度不超過(guò)1%。培養(yǎng)24h后,顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。體外藥物敏感性分析針對(duì)藥物單體,以幾種腫瘤細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?以MTT實(shí)驗(yàn)法分析其體外抗腫瘤活性。(2)細(xì)胞培養(yǎng)和集落形成首先制備底層瓊脂,將其加入12孔板中,每孔2mL室溫放置1h以上,待其充分凝固。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞用含0.01%EDTA的0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化,用培養(yǎng)基稀釋成單細(xì)胞懸液,并調(diào)整濃度至1×104個(gè)細(xì)胞/mL。然后取42℃預(yù)溫的瓊脂粉/培養(yǎng)基混合物1.2mL與0.8mL含有不同藥物的細(xì)胞懸液迅速混勻,取1mL鋪于底層瓊脂之上,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置室溫待其充分凝固后,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。在顯微鏡下觀察集落形成情況并計(jì)數(shù)。集落計(jì)數(shù)方法:在鏡下隨機(jī)記數(shù),每一孔中5個(gè)視野內(nèi)的集落數(shù)(集落確定標(biāo)準(zhǔn):4個(gè)細(xì)胞以上),計(jì)算各自總和,取3復(fù)孔的平均數(shù)做比較。(3)細(xì)胞毒性試驗(yàn)合成化合物或植物提取物純品的半數(shù)抑制濃度IC50<10ug/mL,或植物粗提物的IC50<20ug/mL,并且有細(xì)胞毒性的劑量依賴關(guān)系,且最高抑制效率達(dá)80%以上,則判定樣品在體外對(duì)細(xì)胞有殺傷作用。6.2動(dòng)物水平的選擇(1)注射方式及藥物分三組,每組三只。藥物溶于橄欖油,以腹腔注射方式給藥,陰性對(duì)照組只注射橄欖油,試驗(yàn)組同時(shí)注射待篩選藥物,200mg/kg體重,2天1次。觀察給藥后行為,為期4周。(2)細(xì)胞成瘤的測(cè)定將小鼠背部皮下接種2×106H22小鼠肝實(shí)質(zhì)瘤細(xì)胞,5-7天后可見(jiàn)成瘤。將40只荷瘤小鼠隨機(jī)分為四組,藥物溶于橄欖油,腹腔注射給藥,試驗(yàn)為期10周。處死小鼠后,收取腫瘤標(biāo)本,稱量腫瘤重量。(3)療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)體瘤的療效以瘤重抑制百分率表示,即瘤重抑制率=(1-試驗(yàn)組瘤重/對(duì)照組瘤重)×100%,中藥抑制率大于30%,合成藥大于40%,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,重復(fù)3次,療效穩(wěn)定,則評(píng)價(jià)有一定抗腫瘤作用。7新靶點(diǎn)、新化合物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用如今,抗腫瘤藥物的篩選已經(jīng)由針對(duì)化合物的篩選體系轉(zhuǎn)變?yōu)獒槍?duì)疾病的篩選體系,但目前所應(yīng)用的篩選系統(tǒng)只適合于隨機(jī)篩選,比較理想的篩選體系應(yīng)該是以機(jī)理為基礎(chǔ)的或針對(duì)機(jī)理的篩選系統(tǒng)。近年來(lái)分子腫瘤學(xué)的研究所取得的進(jìn)