冠心病血瘀證與一般血漿中的蛋白組分析

冠心病血瘀證與一般血漿中的蛋白組分析

冠狀動脈硬化是一種嚴重危害人類健康的常見疾病。它的發(fā)生與脂質(zhì)代謝障礙、血管內(nèi)皮細胞損傷、單核細胞移植和切下致切物細胞分離以及mcclovac細胞的形成、細胞壞死和脂質(zhì)積累有關。血瘀證是冠心病的常見中醫(yī)證型,活血化瘀是治療冠心病的常用方法。先前通過的血液流變學、微循環(huán)和分子生物學等方法對冠心病血瘀證進行了大量的實驗與臨床研究,對揭示證的實質(zhì)起到了重要作用。蛋白質(zhì)組學是一種新的研究手段,蛋白質(zhì)組是指由一個基因組、一種生物或一種細胞/組織表達的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組研究的技術路線主要是高通量雙向電泳進行蛋白質(zhì)的分離,再用專業(yè)計算機軟件進行圖像分析,然后通過質(zhì)譜技術及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫信息對凝膠上的蛋白質(zhì)進行分析和鑒定。由雙向電泳、質(zhì)譜、計算機圖像數(shù)據(jù)處理組成的蛋白質(zhì)組學的技術體系具有高通量、高分辨率和高重復性的特點,能對微量樣品進行全面自動定量分析,并在疾病診斷物的發(fā)現(xiàn)、藥物作用靶標、安全性評價、耐藥性機制、疾病動物模型研制和中醫(yī)藥現(xiàn)代化等方面得到應用。而應用于臨床診斷的疾病標志物應該是容易獲取并易于隨時檢測的,正是基于這樣的考慮,我們采用蛋白質(zhì)組學技術比較正常人與冠心病血瘀證病人血漿中的蛋白質(zhì)差異,以期發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證病人血漿中的診斷標志物。1數(shù)據(jù)和方法1.1診斷標準的制定選擇2003年10月—2004年2月住院的冠心病血瘀證病人8例,均符合WHO/ISEC1979年制定的《缺血性心臟病的命名和診斷標準》及中國中西醫(yī)結(jié)合活血化瘀研究專業(yè)委員會1986年制定的血瘀證診斷標準,年齡55歲~65歲。正常健康人(對照組)8例,為本院健康查體者,年齡54歲~65歲。1.2培養(yǎng)液、胎牛血清及去蛋白試劑IPG緩沖液、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等雙向電泳試劑均購自Amershampharmacia公司;DNA和RNA酶購自Sigma公司;蛋白質(zhì)酶抑制劑、胰酶購自Roche公司;二甲基甲酰胺、賴氨酸購自Roche公司;蛋白質(zhì)定量標準考馬斯亮藍R-250、考馬斯亮藍G-250購自Amresoco公司。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自GIBCO公司,腫瘤壞死因子(TNF-α)購自Sigma公司。去除白蛋白試劑盒購自Pierce公司。儀器為Amershampharmacia公司蛋白質(zhì)學研究配套儀器:IPGphor等電聚焦儀,EttanDALTsix雙向垂直電泳儀,MultiTempⅢ溫控循環(huán)水浴,ImageScanner掃描儀,Imagemaster2DElite圖像分析軟件,Imagemaster2DDatabase數(shù)據(jù)庫軟件,Typhoon9410掃描1)本課題為北京中醫(yī)藥重點學科項目,北京中醫(yī)藥“125”人才培養(yǎng)計劃項目儀,DecyderDifferentialin-gelAnalysisVersion4.00.06和BiologicalVariationAnalysis圖像分析軟件。1.3理論血漿蛋白樣品,進一步擴大血漿相對于人體的覆蓋面取1mL抗凝血液,4℃放置30min后,離心(3000r/min,15min),取上清轉(zhuǎn)移至Ep管,離心(7500r/min,30min),取上清,從8份血漿樣品中各吸取100μL血漿合并,得到正常人和病人血漿蛋白樣品。1.4抗白蛋白抗體從血漿中去除白蛋白:加抗白蛋白抗體株到離心管中,然后加380μL雙蒸水作用20s,離心(12000r/min,1min),棄去洗脫液。加80μL血漿到離心管中,與抗白蛋白抗體反應1min,離心(12000r/min,1min),收集洗脫液,將洗脫液再加到離心管中,再次與抗白蛋白抗體反應1min,離心(12000r/min,1min),收集洗脫液。加50μL緩沖液到離心管中,與抗白蛋白抗體株反應1min,離心(12000r/min,1min),收集洗脫液。將洗脫液合并,得到去除白蛋白的血漿蛋白樣品。1.5ndad染色將蛋白質(zhì)定量標準(Albuminstandard)梯度稀釋后用考馬斯亮藍G-250染色,波長595nm測定吸收度,做標準曲線,樣品稀釋100倍測定蛋白質(zhì)濃度。1.6ipg膠條的等電聚焦分別取正常和TNF-α處理細胞的蛋白質(zhì)制成第一向等電聚焦體系。采用膠內(nèi)泡漲方法,樣品和泡漲液(8mol/L尿素、2%CHAPS、20mmol/LDTT、0.5%IPG緩沖液、痕量溴酚藍)共450μL,揭下IPG膠條的保護膜,膠面向下,先將IPG膠條尖端朝標準型膠條槽的尖端方向放入膠條槽中,慢慢下壓膠條,并前后移動,避免生成氣泡,最后放下IPG膠平端,使溶脹液浸濕整個膠條,從IPG膠條兩側(cè)加入ImmobilineDryStrip覆蓋油,蓋上蓋子。將膠條槽放置于等電聚焦上,注意電極接觸良好,設置等電聚焦參數(shù):30V,12h;200V,1h;500V,1h;1000V,1h;8000V,8h(pH3~pH10),8000V,10h(pH4~pH7),8000V,12h(pH6~pH9)。最后選擇等電參數(shù)8000V,10h(pH4~pH7)。1.7第二次平衡過程IPG膠條平衡2次,每次15min。平衡緩沖液包括6mol/L尿素和30%甘油,可減少電內(nèi)滲,有利于蛋白質(zhì)從第一向轉(zhuǎn)移到第二向的轉(zhuǎn)移。第二次平衡步驟中加入260mmol/L碘乙酰胺,以除去多余的DTT。平衡后的膠條用去離子水潤洗后,將膠條的邊緣置于濾紙上幾分鐘,以除去多余的平衡緩沖液。將IPG膠條小心地放置于第二向制好的SDS膠上,并輕壓使IPG膠條與SDS膠充分結(jié)合,注意膠面之間不能有氣泡,用0.5%瓊脂糖封頂,進行雙向電泳,雙向電泳參數(shù)為80mA,40min,調(diào)至120mA,到溴酚藍染料遷移到膠的底部邊緣結(jié)束電泳。1.8藍、甲醇、10%冰醋酸染色考馬斯亮藍染色液(0.1%考馬斯亮藍、50%甲醇、10%冰醋酸)染色6h,考馬斯亮藍脫色液(25%乙醇、8%冰醋酸)脫色12h。1.9碳酸氫銨溶液選取2D膠上存在明顯差異的蛋白質(zhì)點,用刀片沿斑點染色邊緣切下蛋白點置于1.5mLEp管中,用含50%乙腈和25mmol/L碳酸氫銨溶液脫色,膠片真空離心干燥。加4μL胰酶,37℃保溫18h,加入5%三氟乙酸120μL于40℃保溫1h,合并上清,加入2.5%三氟乙酸和50%乙腈溶液120μL于30℃保溫1h,并發(fā)上清液冷凍干燥。1.10氟乙酸質(zhì)譜儀μL三氟乙酸溶解樣品,取1μL點靶,另取1μLα-腈基-4-羥基肉桂酸溶于0.1%三氟乙酸,50%乙腈的飽和溶液作基質(zhì),室溫干燥。質(zhì)譜儀采用激光波長337nm,反射檢測。質(zhì)譜峰用Bruker的肽段標準或胰酶的自切峰(MH+:906.505Da,1020.504Da,1153.574Da,2163.057Da,2273.160Da)進行標定。1.11數(shù)據(jù)庫中尋找和篩選蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索程序根據(jù)輸入的蛋白質(zhì)等電點、分子量范圍及肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)和其他一些參數(shù)在數(shù)據(jù)庫中尋找與這些參數(shù)相匹配的蛋白質(zhì)。檢索參數(shù)為①種屬選擇人;②胰酶酶切;③可變修飾選擇氨基甲?；脱趸?④漏切點選擇1;⑤肽質(zhì)量標準差選擇0.3;⑥單同位素質(zhì)量。2結(jié)果2.1冠心病血紅蛋白點的變化分別將正常健康者和冠心病心血瘀阻證病人的除去白蛋白的血漿蛋白質(zhì),進行三次雙向電泳,第一向用pH為4~7,長度為24cm的預制膠條,第一向結(jié)束后進行SDS電泳,圖像分析時將正常人血漿的凝膠選鐵參考膠,其他膠與參考膠相匹配,蛋白質(zhì)點經(jīng)標準化后輸出數(shù)據(jù)到Excel進行統(tǒng)計分析。正常人和冠心病血瘀證病人血漿的雙向電泳凝膠上的蛋白質(zhì)點的個數(shù)分別為256±11、273±12。冠心病血瘀證血漿蛋白質(zhì)中改變的蛋白質(zhì)點可通過統(tǒng)計而得到。因為與疾病有關的蛋白質(zhì)在3次實驗中均表現(xiàn)為上升或下降,如果一個蛋白質(zhì)點在3次實驗中有時上升有時下降,這可能是因為樣品制備、雙向電泳等原因引起,這樣的蛋白質(zhì)點暫不考慮,以排除實驗的假陽性。圖像分析統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證病人血漿與正常人相比有3個蛋白質(zhì)下調(diào)和6個蛋白質(zhì)上調(diào)。詳見表1。2.2膠內(nèi)酶切提取蛋白的檢測選取圖像分析統(tǒng)計后病人血漿與正常人相比有改變的蛋白質(zhì)點,膠內(nèi)酶切提取蛋白進行質(zhì)譜鑒定,其中冠心病血瘀證病人血漿與正常人相比升高的蛋白質(zhì)有免疫球蛋白、纖維蛋白原、粒酶,冠心病心血瘀阻證病人血漿與正常人相比降低的蛋白質(zhì)有CD44SP。3維護血管內(nèi)皮細胞血漿蛋白質(zhì)組學的研究結(jié)果表明,冠心病血瘀證病人血漿中纖維蛋白原的水平升高,且與冠心病和卒中的發(fā)生率上升有關,纖維蛋白原是心血管病的一個獨立的可改變的危險因素。急性或緩慢的纖維蛋白原升高通過幾條途徑導致心血管病,尤其是動脈粥樣硬化灶。纖維蛋白原是由肝臟產(chǎn)生的一種黏附蛋白,可以被血小板α顆粒攝取并儲存。纖維蛋白原在冠狀動脈粥樣硬化形成早期,即與低密度脂蛋白一起侵入動脈壁,它可直接損傷血管內(nèi)皮細胞并破壞血管內(nèi)皮細胞的抗凝和纖溶活性。纖維蛋白原通過其在血小板上的配體血小板膜糖蛋白(Gp)Ⅱb/Ⅲa使血小板聚集及血小板與單核細胞的黏附,促進炎癥和血栓形成。纖維蛋白原的另一重要功能是通過其r3序列結(jié)合到細胞間黏附分子-1(ICAM-1)并調(diào)整ICAM-1依賴性黏附,作為內(nèi)皮細胞和單核細胞間必需的橋連子而在冠狀動脈粥樣硬化的免疫炎癥反應中起重要作用。纖維蛋白原作為冠心病的獨立危險因素,在冠狀動脈粥樣硬化斑塊中和動脈粥樣硬化病人血中表達增高,并且其表達量隨臨床嚴重程度的加重而增加。研究發(fā)現(xiàn),纖維蛋白原除了參與凝血過程外,還刺激血管平滑肌的遷移和增殖,促進血小板聚集性增高,血黏稠度改變。故認為高纖維蛋白原血癥在動脈內(nèi)壁的沉積可能先于低密度脂蛋白的沉積,在冠心病的發(fā)展中,特別是早期其作用可