關(guān)于單抗原液車間設(shè)計的探討

Part1、關(guān)于單抗病毒的風(fēng)險

CHO細胞系是制造許多治療性蛋白質(zhì)的主力。CHO細胞的生物安全等級為一級，CHO本身存在內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，這是已經(jīng)被證實了的，但這種病毒對人類不具有致病性。從藥物質(zhì)量安全角度出發(fā)，遵循SFDA公布的《人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》，加入病毒去除和滅活方法。此外，基于哺乳動物細胞進行的培養(yǎng)發(fā)酵，產(chǎn)品被病毒污染是考慮的主要生產(chǎn)風(fēng)險之一。病毒污染的其他潛在來源可能還有：使用已經(jīng)被污染了的主細胞種子庫或工作細胞種子庫；操作員可能帶進病毒，污染工藝；細胞線殘留上一級仍有活力的病毒。因為哺乳動物細胞為帶入的病毒污染物提供了合適的宿主細胞，因此病毒量可能會隨著細胞培養(yǎng)而放大，進而可能增加生產(chǎn)過程的整體風(fēng)險。Part2、單抗原液車間的設(shè)計理念

為了最小化病毒污染的風(fēng)險或降低將污染物攜帶至最終產(chǎn)品的風(fēng)險，盡量減輕生產(chǎn)環(huán)境的微生物負載，所有帶有病毒風(fēng)險的工藝步驟應(yīng)該在各自獨立生產(chǎn)間中完成，采取單向流設(shè)計。單向流是通過將車間分為供應(yīng)側(cè)走廊（共用的供應(yīng)走廊，進入工藝間的人物流通道）和廢棄物走廊（用于收集各個生產(chǎn)工藝間潛在被污染的物料的共用走廊）實現(xiàn)的。在廢棄物走廊收集的物料和廢棄物需經(jīng)過充分處理后，才能轉(zhuǎn)運至供應(yīng)側(cè)，要避免攜帶污染物。物料經(jīng)過雙扉式滅菌柜去污后，才能從返回走廊進入潔凈區(qū)。Part3、生產(chǎn)工藝核心內(nèi)容的設(shè)計要點

單抗原液的生產(chǎn)工藝主要概括為兩個階段：上游細胞的培養(yǎng)、發(fā)酵和下游的純化。細胞種子經(jīng)搖瓶、WAVE反應(yīng)器、一、二、三級種子培養(yǎng)擴增后進入發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)離心機進入下游進行純化。離心后的料液經(jīng)過層析、超濾后變成原液。原液生產(chǎn)過程中還有輔助系統(tǒng)：培養(yǎng)基配制、緩沖液配制以及CIP等系統(tǒng)，如圖1和圖2所示。具體的工藝流程描述如下：具體的工藝流程描述如下：（1）細胞復(fù)蘇

細胞復(fù)蘇和凍存講究“慢凍快溶”，復(fù)蘇時一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細胞凍存液快速融化至37℃，使胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。（2）細胞傳代培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)是指細胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)進行生長繁殖，能連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)收獲的培養(yǎng)技術(shù)。通常待培養(yǎng)液中酚紅指示劑變黃，在已紫外滅菌后的超凈臺上吸出或倒出細胞懸液至離心管中離心，棄去舊培養(yǎng)液，加新培養(yǎng)液，充分吹打以分散細胞。吸取適量細胞懸液轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，或直接取適量細胞懸液至新培養(yǎng)瓶中，再補加一定量新鮮完全培養(yǎng)液進行傳代，有些脆弱的細胞用自然沉降法沉降細胞，吸去上面舊培養(yǎng)液加入新的完全培養(yǎng)液后吹散進行傳代。優(yōu)點：擴大培養(yǎng)比較容易，占地面積小，培養(yǎng)過程簡單，細胞增殖快。缺點：只有少數(shù)細胞適合懸浮培養(yǎng)。貼壁細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)貼壁依賴型細胞最初采用轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)培養(yǎng)，這種培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段。瓶底中細胞覆蓋率達70%~80%時，在經(jīng)紫外滅菌后的超凈臺上，棄去舊細胞培養(yǎng)液，加預(yù)熱好的新鮮完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打使細胞脫落且分散均勻，直接吸取適量細胞懸液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中或離心去除上清液，加適量新鮮完全培養(yǎng)液吹打重懸細胞，然后轉(zhuǎn)移適量細胞懸液至新培養(yǎng)瓶中，再加入一定量完全培養(yǎng)液，搖勻瓶底細胞液后進行培養(yǎng)。優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，投資少，技術(shù)成熟、重復(fù)性好、放大只需簡單地增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量。缺點：勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小、細胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和監(jiān)控環(huán)境條件受限制[2]。（3）細胞培養(yǎng)我國動物細胞培養(yǎng)方式大多采用微載體培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)就是加入微載體，使其懸浮在生長液中，這樣不能懸浮的細胞就可以貼附在微載體表面上進行生長繁殖。這種培養(yǎng)方式兼顧了單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點，通常分為連續(xù)灌流和流加培養(yǎng)。灌流培養(yǎng)，在細胞培養(yǎng)過程中，不斷向培養(yǎng)器灌流培養(yǎng)液，同時以相同流量流出。灌流工藝的優(yōu)點是維持較低的培養(yǎng)液濃度，有利于目標(biāo)產(chǎn)品的形成，同時不斷流出的培養(yǎng)液可以帶出細胞碎片和副產(chǎn)物，降低細胞代謝釋放的各種酶類，提高設(shè)備利用率和單位時間產(chǎn)量。流加培養(yǎng)，在細胞培養(yǎng)過程中，采用攪拌式系統(tǒng)連續(xù)懸浮培養(yǎng)。細胞接種的培養(yǎng)基料液體積一般為終體積的1/2左右，過程中根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗情況和需求量往培養(yǎng)器中流加營養(yǎng)物質(zhì)或培養(yǎng)液，補充碳源、氮源、微量元素等，促進細胞持續(xù)生長，提高目標(biāo)產(chǎn)品的收率和品質(zhì)。（4）單抗發(fā)酵液分離工藝細胞收獲液的澄清是生物制藥中開啟下游工藝的第一步，為下游純化提供無雜質(zhì)的料液，生物制品的有效成分多為蛋白質(zhì)和多糖等生物活性大分子，因此，在生產(chǎn)中常用的分離方法主要有細胞破碎技術(shù)、沉淀技術(shù)、離心技術(shù)、過濾技術(shù)和色譜分離技術(shù)，通常采用溫和的多階式逐級分離的方式。如果只采用一種過濾技術(shù)，通常會選用兩級過濾：首先使用孔徑較大的過濾介質(zhì)去除細胞或者細胞碎片；接著使用孔徑緊密的過濾介質(zhì)去除膠體雜質(zhì)。對于高密度細胞收獲液，可以選擇絮凝法配合深層過濾。避免下游層析純化柱過早堵塞，降低生物負載，澄清工藝最后會配合0.45μm、0.2μm的終端除菌過濾。（5）單抗下游純化單克隆抗體藥品生產(chǎn)通常包含四個模塊：上游培養(yǎng)（Upstremprocess）、下游純化（Downstremprocess）、分析質(zhì)控（Analysis）和制劑（Formulation）[3]。下游就是純化，下游從上游拿到細胞培養(yǎng)澄清液后，進行純化生產(chǎn)得到藥物原液。下游純化工藝依靠三種層析柱和兩種濾膜。三種層析柱一般指rProteinA（recombinantproteinA）親和層析柱、陽離子交換層析柱（cationexchangechromatography，CEX）和陰離子交換層析柱（anionexchangechromatography，AEX）。兩種濾膜是指除病毒納濾膜（viralfilter）和超濾膜（ultrafiltration/diafiltration，UF/DF）。（6）病毒的去除單抗生產(chǎn)工藝中一般最有效的病毒去除/滅活方法有：低pH值（pH值=3.2保持30~60min）、加熱（55~65℃保持1h）、S/D（溶劑/去污劑）、膜過濾（如納濾）等。在抗體工藝流程設(shè)計中，典型的設(shè)計是在ProtienA親和層析后加上病毒滅活工藝。將親和層析后的合并洗脫液進行低pH孵育，用強酸緩沖液將洗脫液pH值調(diào)低（pH值=3.2保持30~60min），然后再迅速用強堿緩沖液將PH值調(diào)至5.5，以利于下一步精純。盡量縮短蛋白質(zhì)在低pH值環(huán)境中暴露的時間。（也有采用磷酸鹽緩沖液代替強酸/強堿HCL/NaOH進行pH調(diào)節(jié)的，但該方法的缺點是會導(dǎo)致下一步精純的工藝體積變大，可能會考慮增加超濾濃縮工藝，使用的較少；而強酸強堿可能會在過程中增加蛋白沉淀的風(fēng)險）。低pH孵育宜采用一次性混合系統(tǒng)（50~1000L），具有低剪切力混合攪拌、在線pH值檢測、無需配備CIP\SIP，有利于質(zhì)量保證和驗證，一個驅(qū)動單元可配合多個一次性混合系統(tǒng)，大大減低固定設(shè)備投資成本，節(jié)約能源。而用于發(fā)酵液純化的親和層析、離子交換層析也具有一定的去病毒能力。單抗工藝中可采用納濾膜過濾作為清除病毒的最終步驟，然后再經(jīng)除菌過濾得到單抗原液（免疫球蛋白）。

Part4工程實例

根據(jù)單抗原液生產(chǎn)的特點以及工程設(shè)計要點，結(jié)合工程實例對車間的平面設(shè)計和空調(diào)凈化系統(tǒng)進行描述和分析。圖3為某單抗原液車間的平面圖。1平面設(shè)計單抗原液生產(chǎn)車間需要依據(jù)生產(chǎn)工藝和制備流程進行設(shè)計分區(qū)，分為上游區(qū)和下游區(qū)兩個主要的生產(chǎn)區(qū)域。上游區(qū)：細胞復(fù)蘇、細胞擴增、細胞培養(yǎng)、收獲；下游區(qū)：原液純化、超濾和過濾除病毒。根據(jù)生產(chǎn)需要，還需設(shè)置兩個輔助功能區(qū)：培養(yǎng)基配制區(qū)和儲存區(qū)、緩沖液配制和儲存區(qū)。設(shè)置人員進入通道和退出通道分開，避免人員退出時對清潔區(qū)域造成污染，車間生產(chǎn)人員通過人凈更衣設(shè)施進入生產(chǎn)凈化區(qū)，并通過供應(yīng)側(cè)走廊進入各個功能間[3]。設(shè)置潔凈物料、非潔凈物料的進入口，原輔料通過物流通道和氣鎖進入生產(chǎn)凈化區(qū)。上游區(qū)和下游區(qū)使用過的器具和產(chǎn)生的廢棄物通過廢棄物處理走廊進入清洗區(qū)進行清洗滅菌。設(shè)立獨立的廢棄物出口，保證廢棄物不會對生產(chǎn)凈化區(qū)造成二次污染。平面布局堅持單向流原則，將車間分為供應(yīng)側(cè)和廢棄物處理走廊。按照人流和物流單向流的理念進行整體空間布局，降低微生物污染的風(fēng)險，有效地控制生物負載和病毒污染。2空調(diào)凈化系統(tǒng)空調(diào)系統(tǒng)依據(jù)生產(chǎn)區(qū)和準(zhǔn)備區(qū)的分區(qū)原則進行分區(qū)，防止交叉污染。作為輔助崗位，培養(yǎng)基配制和緩沖液配制兩個區(qū)域與上下游生產(chǎn)區(qū)相對獨立。人凈設(shè)施和供應(yīng)側(cè)走廊、細胞庫、上游區(qū)、下游區(qū)以及廢棄物處理走廊等分別設(shè)立獨立的空調(diào)系統(tǒng)。下游區(qū)里純化工藝、原液的超濾和除病毒過濾均設(shè)置在一個空調(diào)分區(qū)內(nèi)。根據(jù)GMP要求，上游區(qū)和下游區(qū)的潔凈等級均為C級?？紤]到單抗產(chǎn)品的工藝特性和產(chǎn)品附加值等因素，空調(diào)系統(tǒng)選擇雙機熱備的形式確保原液的生產(chǎn)環(huán)境。凈化空調(diào)系統(tǒng)在送風(fēng)系統(tǒng)的終端設(shè)置HEPA，采用定送變排的空調(diào)模式。換氣次數(shù)不低于40次/h?？刂茐翰钐荻?，確保氣流從低污染風(fēng)險區(qū)向高污染風(fēng)險區(qū)流動，即從上游區(qū)流向下游區(qū)。病毒去除和滅活間等污染程度高的房間要保持相對負壓狀態(tài)。生產(chǎn)車間凈化空調(diào)系統(tǒng)采用定風(fēng)量定新風(fēng)比一次回風(fēng)系統(tǒng)?？諝饨?jīng)過初效、中效、高效過濾器三級過濾送至房間。監(jiān)測潔凈區(qū)相關(guān)的關(guān)鍵環(huán)境參數(shù)，如溫濕度、壓差、風(fēng)速等。當(dāng)環(huán)境溫濕度、壓差超過設(shè)定范圍時，系統(tǒng)聲光報警和記錄，同時系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行歸檔[4]。潔凈區(qū)各房間合理確定壓差梯度，氣流從清潔走廊流向污物走廊。Part5、單抗原液純化工藝所需設(shè)備的選擇

1離心機離心機是利用離心機轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生強大的離心力，迫使液體中的懸浮微?？朔U散作用而加快其沉降速度。這里的懸浮微粒往往是指懸浮狀態(tài)的細胞、細胞器、病毒和生物大分子等。工業(yè)上大多應(yīng)用Disk-stack離心去除細胞及其碎片。Disk-stack離心可以連續(xù)離心，提高處理量，縮短處理時間。在離心工藝開發(fā)過程中，有很多參數(shù)需要優(yōu)化，如補料的速度、離心機轉(zhuǎn)速、濾餅層的去除頻率等，這些參數(shù)會影響到細胞的穩(wěn)定性、處理的時間以及抗體收率等?？捎猛ㄟ^優(yōu)化這些參數(shù)，合理地使各種訴求達到平衡。2過濾器利用多孔物質(zhì)作為介質(zhì)，借助過濾介質(zhì)的篩分性質(zhì)，且一般介質(zhì)表面都在外力的作用下，通過介質(zhì)孔道對不同的組分進行分離、提純、富集的技術(shù)。相對其他的分離技術(shù)，過濾分離技術(shù)應(yīng)用廣泛，工藝簡單，高效節(jié)能。當(dāng)原液中顆粒含量高時，往往選擇深層過濾。深層過濾介質(zhì)一般由纖維素或聚丙烯纖維柱床、過濾介質(zhì)（如硅藻土）和粘合劑（用于制作平整的界面）組成。由于離心不能完全去除細胞及其碎片，而切向流成本太高，所以深層過濾通常被用于離心之后，也可以單獨用于細胞發(fā)酵液的澄清。由于深層過濾介質(zhì)的孔徑并不均一，所以在深層過濾之后會緊接一個除菌過濾工藝，以利于色譜柱的純化。3樹脂柱親和層析柱rProteinA、陽離子交換層析柱（CEX）、陰離子交換層析柱（AEX）。第一根層析柱是親和層析柱rProteinA，生物大分子的層析方法主要分為親和，離子交換，疏水作用及體積排阻。親和層析是利用介質(zhì)上的配基與目標(biāo)蛋白分子有特異性結(jié)合，而對其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不吸附，因此雜質(zhì)從層析柱中流出，被吸附的目標(biāo)生物分子通過改變洗脫液的條件使被分離物質(zhì)與配基解吸附，即可達到分離純化的目的。它可以去除90%以上的HCP和DNA，甚至一步就可以獲得抗體純度大于98%，而且在回收率上也有明顯優(yōu)勢，親和捕獲回收率可達95%。第二根柱是陽離子交換層析柱（CEX）[5]。在抗體純化工藝中，CEX一般使用吸附模式。陽離子交換可以去除HCP、親和層析柱脫落的物質(zhì)以及部分高分子量的聚體等雜質(zhì)。通常陽離子交換層析柱不承擔(dān)去病毒任務(wù)，卻可以輔助去除病毒。第三根柱就是陰離子交換層析柱（A