一測(cè)多評(píng)法的研究進(jìn)展

一測(cè)多評(píng)法的研究進(jìn)展

中藥的特點(diǎn)是組件多因素的聯(lián)合使用，這表明通過(guò)測(cè)定單一成分的含量，很難全面評(píng)價(jià)中藥的整體質(zhì)量?，F(xiàn)有的中藥質(zhì)量控制模式逐漸從測(cè)定單一成分向同時(shí)測(cè)定多個(gè)成分進(jìn)行轉(zhuǎn)變。但是,所需中藥化學(xué)對(duì)照品種類(lèi)較多、部分對(duì)照品難以制備或不穩(wěn)定等因素仍然是阻礙中藥多成分質(zhì)量控制發(fā)展的一個(gè)難題。一測(cè)多評(píng)法(Quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-maker,QAMS)通過(guò)成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系,僅測(cè)定一個(gè)易制備且性質(zhì)穩(wěn)定的成分從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)待測(cè)成分的同步測(cè)定,是一種適合中藥特點(diǎn)的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)模式。《美國(guó)藥典》34版有25個(gè)天然藥物及其制劑的標(biāo)準(zhǔn)使用QAMS;《歐洲藥典》7.0版有9個(gè)天然藥物標(biāo)準(zhǔn)使用QAMS;《中國(guó)藥典》2010年版黃連的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)使用了QAMS,以鹽酸小檗堿為內(nèi)參物測(cè)定了黃連中小檗堿、表小檗堿、黃連堿和巴馬汀4個(gè)生物堿的含量。近年來(lái),QAMS在中藥材及中藥制劑的質(zhì)量控制研究中受到了越來(lái)越多的關(guān)注,這些研究結(jié)果將為《中國(guó)藥典》2015年版中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。本文介紹了QAMS的基本原理及特點(diǎn),概述了近8年來(lái)QAMS在中藥質(zhì)量控制中的研究進(jìn)展,并對(duì)研究和應(yīng)用中內(nèi)參物的選擇、校正因子的計(jì)算方法與耐用性考察等關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行了探討。1多元統(tǒng)治的基本概述1.1測(cè)定參比及相對(duì)校正因子在一定的線性范圍內(nèi),成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測(cè)器的響應(yīng)成正比。在多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí),以藥材中某一典型組分(對(duì)照品易得、穩(wěn)定)作為內(nèi)參物(k),建立內(nèi)參物與其他待測(cè)組分(x)間的相對(duì)校正因子[(referencecorrectionfactor,RCF(fkx)]為公式(1):式中,Ak和Ax為內(nèi)參物對(duì)照品和其他待測(cè)成分對(duì)照品的峰面積;Wk和Wx為內(nèi)參物對(duì)照品和其他待測(cè)成分對(duì)照品的濃度。由公式(1)可以推導(dǎo)出利用RCF計(jì)算樣品中其他待測(cè)組分含量的公式(2):式中,fkx為對(duì)照品溶液測(cè)得的RCF;Ak和Ax為內(nèi)參物樣品和其他待測(cè)成分樣品的峰面積,Wk為內(nèi)參物樣品的濃度。1.2worm的特點(diǎn)1.2.1對(duì)照品純度及待測(cè)成分的測(cè)定QAMS主要適用于對(duì)照品難得、不穩(wěn)定、制備成本高的情況下同類(lèi)多成分的同時(shí)測(cè)定。要求對(duì)照品純度QAMS>98%,且樣品中待測(cè)成分應(yīng)有相對(duì)較高的含量(≥1mg/g)。QAMS(RCF)耐用性考察、QAMS與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都應(yīng)在可接受的范圍內(nèi)(RSD<5%)。1.2.2更全面、準(zhǔn)確、科學(xué)的測(cè)定中藥質(zhì)量控制了同步檢測(cè)的難度以及提高了同步測(cè)定用戶檢測(cè)成本的提高QAMS僅使用一個(gè)對(duì)照品實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分的同步測(cè)定,降低了購(gòu)買(mǎi)分離純化困難、不穩(wěn)定對(duì)照品的難度以及購(gòu)買(mǎi)價(jià)格昂貴對(duì)照品的檢測(cè)成本,更全面、準(zhǔn)確地對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量控制。同時(shí)提高了同步測(cè)定多個(gè)成分的工作效率,更快捷、簡(jiǎn)便地分析了中藥質(zhì)量。建立QAMS經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的方法學(xué)考察且結(jié)果良好,能直接運(yùn)用于含有同類(lèi)成分的中藥制劑的質(zhì)量控制,節(jié)約了檢測(cè)成本與檢測(cè)時(shí)間。1.3worm的使用1.3.1分析方法的評(píng)價(jià)已開(kāi)展QAMS研究的中藥材或制劑多達(dá)數(shù)十種,大多都是針對(duì)同類(lèi)成分的含量測(cè)定。按照化合物結(jié)構(gòu)類(lèi)型主要可分為對(duì)以下幾類(lèi)成分的測(cè)定及應(yīng)用:皂苷類(lèi)成分:朱晶晶等選擇人參皂苷Rb1作為內(nèi)參物,同時(shí)測(cè)定了人參中的8種人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd和三七中的3種人參皂苷Rg1、Rh1、Rd,RCF耐用性考察RSD<4%,表明在紫外吸收特征相似的同類(lèi)化合物間開(kāi)展QAMS研究是可行的,解決了人參等藥材質(zhì)量控制中對(duì)照品供應(yīng)不足的問(wèn)題。王超群等以三七中的5種活性人參皂苷Rg1、Rb1、Rd、Re、R1中的任一種作為內(nèi)參物,測(cè)定其他4種成分;RCF耐用性考察RSD<5%,較2010年版《中國(guó)藥典》中三七的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多檢測(cè)了2個(gè)主要成分Re、Rd,表明該方法可用于三七質(zhì)量的全面控制。LiYB等以淫羊藿為研究對(duì)象,一方面以淫羊藿苷為內(nèi)參物測(cè)定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ;另一方面選擇藥材中沒(méi)有的成分蘆丁為外源內(nèi)參物測(cè)定5個(gè)皂苷成分,兩種方法與外標(biāo)法比較均沒(méi)有明顯的差異,表明建立的兩種方法均可以用于淫羊藿及其相關(guān)藥材或制劑的質(zhì)量控制。醌類(lèi)成分:GaoXY等以大黃素為內(nèi)參物,建立與大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、番瀉苷A及番瀉苷B的RCF,QAMS與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果相對(duì)誤差<0.1%,表明該方法準(zhǔn)確可靠。王鈺瑩等以三黃片中大黃蒽醌類(lèi)成分為研究對(duì)象,建立了大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素的RCF(RSD<3%),QAMS與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果RSD<4%,表明測(cè)定的RCF可靠,被直接引用于后續(xù)新清寧片中4個(gè)蒽醌類(lèi)成分的測(cè)定,證實(shí)了將經(jīng)過(guò)系統(tǒng)考察的RCF直接應(yīng)用于含相同成分中藥制劑的質(zhì)量控制是可行的。吳笛等以丹參酮ⅡA為內(nèi)參物,測(cè)定了復(fù)方丹參片中的二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ,QAMS與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異,表明可用QAMS對(duì)復(fù)方丹參片中的丹參酮類(lèi)成分含量進(jìn)行評(píng)價(jià)。HouJJ等以丹參酮ⅡA為內(nèi)參物,建立與隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的RCF,系統(tǒng)地考察了校正因子(CF)的影響因素,為QAMS的研究應(yīng)用提供了參考,并且以此建立的丹參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已被《美國(guó)藥典》收錄。黃酮類(lèi)成分:楊菲等以銀黃制劑為研究對(duì)象,選擇黃芩苷為內(nèi)參物,建立與漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的RCF(RSD<5%),在后續(xù)三黃片的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證了相同成分對(duì)應(yīng)RCF的準(zhǔn)確性(RSD<2.5%),表明建立的RCF可靠;馮偉紅等直接引用該RCF測(cè)定了雙黃連制劑中相同的4個(gè)黃酮成分,與2010年版《中國(guó)藥典》僅以黃芩苷作為檢測(cè)指標(biāo)相比,能更準(zhǔn)確、全面地評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量。李?lèi)?ài)紅等建立山奈素、異鼠李素與內(nèi)參物槲皮素的RCF,重復(fù)性考察(RSD<3%),QAMS與外標(biāo)法測(cè)定含量經(jīng)過(guò)配對(duì)樣品t檢驗(yàn)分析無(wú)明顯差異,是QAMS首次應(yīng)用于銀杏葉膠囊的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)。有機(jī)酸類(lèi)成分:李安平等測(cè)定了丹參注射液中的6個(gè)水溶性成分:丹參素鈉、原兒茶醛、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸及丹酚酸B,比較了丹參素鈉、原兒茶醛分別作為內(nèi)參物時(shí)QAMS和外標(biāo)法定量結(jié)果的差異,RSD分別為7.88%~33.45%、0.10%~5.22%,故選擇原兒茶醛作為內(nèi)參物,測(cè)得RCF的耐用性良好(RSD≤5%),節(jié)約了多成分含量測(cè)定成本。吳笛等以含量較多、相對(duì)穩(wěn)定的丹參素鈉為內(nèi)參物,測(cè)定了復(fù)方丹參片中的丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B,QAMS與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異,表明QAMS控制復(fù)方丹參片中丹參酚酸類(lèi)成分的含量是可行的。鄭榮等以綠原酸為內(nèi)參物,同時(shí)測(cè)定金銀花提取物中的新綠原酸、隱綠原酸、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-二咖啡?？崴?、4,5-二咖啡酰奎尼酸5個(gè)成分,解決了隱綠原酸等對(duì)照品購(gòu)買(mǎi)不到的難題,QAMS與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果RSD<0.1%,表明該方法可全面有效地控制金銀花提取物的質(zhì)量。生物堿類(lèi)成分:孔晶晶等以香連制劑為研究對(duì)象,選擇主要有效成分小檗堿為內(nèi)參物,建立與表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的RCF,通過(guò)比較QAMS和標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果,對(duì)不同批次的香連膠囊、香連丸、香連片的質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)。陳靜等以苦參中的氧化苦參堿為內(nèi)參物,建立與槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿的RCF,重現(xiàn)性良好(RSD<4%),可作為一個(gè)穩(wěn)定的參數(shù)運(yùn)用于5種生物堿的含量測(cè)定。趙君穎等和劉暉暉等參照《中國(guó)藥典》2010年版黃連中的表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿4個(gè)生物堿的測(cè)定數(shù)據(jù),分別直接測(cè)定了黃連不同炮制品、黃連配方顆粒中4個(gè)生物堿的含量。結(jié)果表明,引用已有標(biāo)準(zhǔn)中的RCF直接測(cè)定相同成分的方法是可行的,能簡(jiǎn)便、快捷地對(duì)含有同類(lèi)成分的中藥制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。其他類(lèi)成分:馮偉紅等以秦皮藥材和飲片中的香豆素為研究對(duì)象,建立典型成分秦皮甲素與秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素的RCF,耐用性考察(RSD<5%),表明RCF具有一定的普適性,可為《中國(guó)藥典》秦皮的多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。徐娜等以芹菜籽原料中的主要成分芹菜甲素為內(nèi)參物,建立與芹菜乙素、新蛇床內(nèi)酯的RCF,QAMS與外標(biāo)法測(cè)定值無(wú)明顯差異,可為芹菜籽的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。1.3.2糖化學(xué)和類(lèi)化法檢測(cè)部分文獻(xiàn)考察了QAMS測(cè)定不同類(lèi)成分含量的可行性,由于同時(shí)測(cè)定不同類(lèi)成分對(duì)儀器及色譜柱的要求更高,使RCF耐用性考察的難度增加。王瑞等以赤芍中的芍藥苷為內(nèi)參物,建立與芍藥苷類(lèi)的芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和沒(méi)食子酸類(lèi)的沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯、五沒(méi)食子?；咸烟枪?個(gè)成分的RCF,耐用性考察(RSD<5%),表明可以采用QAMS測(cè)定赤芍中的不同類(lèi)成分。劉志輝等以麥貞花顆粒中的蘆丁(黃酮類(lèi))為內(nèi)參物,建立與羥基紅花黃色素A(單查爾酮苷類(lèi))、特女貞苷(環(huán)烯醚萜類(lèi))的RCF,耐用性考察結(jié)果良好。丁黎艷等以相對(duì)價(jià)廉易得的補(bǔ)骨脂素(香豆精類(lèi))作為內(nèi)參物,測(cè)定了補(bǔ)骨脂藥材中的異補(bǔ)骨脂素(香豆精類(lèi))、補(bǔ)骨脂甲素(二氫黃酮類(lèi))、補(bǔ)骨脂乙素(查耳酮類(lèi)),QAMS與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。HouJJ等選擇苯甲酸乙酯作為外源內(nèi)參物,建立了與甘遂中的3個(gè)假白欖酮型二萜類(lèi)、8個(gè)巨大戟二萜醇型二萜類(lèi)、2個(gè)三萜類(lèi)共13個(gè)不同類(lèi)成分的RCF,t檢驗(yàn)比較QAMS與外標(biāo)法的日內(nèi)精密度測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異,并系統(tǒng)地考察了柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)等8個(gè)色譜參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響,為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供了參考。2關(guān)于qms問(wèn)題的討論2.1影響rcf的因素2.1.1rsd的優(yōu)化相對(duì)于其他待測(cè)成分,內(nèi)參物需滿足以下條件:在樣品中含量較高、分離制備簡(jiǎn)單、單體較為穩(wěn)定、容易購(gòu)買(mǎi)和價(jià)格低廉。如果測(cè)定成分中有兩個(gè)以上滿足條件,可通過(guò)比較QAMS與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果或RCF耐用性考察的RSD進(jìn)行選擇。例如,丹參注射液6個(gè)水溶性成分的含量測(cè)定中,丹參素鈉與原兒茶醛均滿足內(nèi)參物的選擇條件,試驗(yàn)中通過(guò)比較兩個(gè)成分分別作為內(nèi)參物時(shí)QAMS與外標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果,優(yōu)選了RSD較小的原兒茶醛作為內(nèi)參物。如果考察結(jié)果的RSD均在可接受的范圍內(nèi),則都可作為內(nèi)參物以增加應(yīng)用中內(nèi)參物對(duì)照品的選擇。例如,中藥三七質(zhì)量控制方法的系統(tǒng)研究中,對(duì)5個(gè)人參皂苷Rg1、Rb1、Rd、Re、R1分別作為內(nèi)參物進(jìn)行了系統(tǒng)的考察,RSD均在可接受的范圍內(nèi),則5個(gè)皂苷都可以作為內(nèi)參物,應(yīng)用中缺乏某一個(gè)對(duì)照品時(shí)能直接使用其他4個(gè)對(duì)照品中的任一個(gè)作為內(nèi)參物,增加了對(duì)照品的選擇性。2.1.2待測(cè)成分濃度的確定CF的計(jì)算方法可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件與數(shù)據(jù)進(jìn)行選擇?，F(xiàn)有QAMS研究CF的計(jì)算方法多采用多點(diǎn)校正法,原理如“1.1QAMS的基本原理”所述:CF(f)=A/W,RCF=fk/fx。但是,有的CF計(jì)算方法實(shí)際為:f=W/A、RCF=fx/fk。多點(diǎn)校正法對(duì)于待測(cè)成分的濃度有一定的要求,濃度過(guò)低線性不準(zhǔn)確,濃度過(guò)高對(duì)線性方程的截距會(huì)有較大的影響,都會(huì)使RCF均值偏差增大。因此使用多點(diǎn)校正法時(shí),待測(cè)成分的濃度應(yīng)有一個(gè)明確的范圍。何兵等提出了計(jì)算CF的另外兩種新方法:斜率校正法和定量因子校正法。斜率校正法須滿足的前提是在標(biāo)準(zhǔn)曲線A=aC+b中,C=A/a-b/a,若a/b值大于100,則忽略b/a的值,以C=A/a直接計(jì)算含量。定量因子校正法所用的CF為斜率校正法所得,計(jì)算結(jié)果與斜率校正法一致,限用于短期內(nèi)、相同實(shí)驗(yàn)條件下大量樣品的復(fù)檢。2.1.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇RCF耐用性指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)RCF對(duì)影響的承受程度,主要是針對(duì)不同的儀器系統(tǒng)以及不同填料、不同型號(hào)的色譜柱。儀器系統(tǒng)的影響主要是因?yàn)闄z測(cè)器的差異,色譜柱的影響則主要是對(duì)各個(gè)成分峰形(分離度、理論板數(shù)、拖尾因子等)的影響。同類(lèi)成分有相似的理化性質(zhì),能適用于較多的儀器與色譜柱;不同類(lèi)成分由于理化性質(zhì)的不同,在不能選擇一個(gè)波長(zhǎng)兼顧各個(gè)成分的情況下,需要選擇不同波長(zhǎng)檢測(cè),增加了對(duì)儀器及色譜柱的要求。檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇是影響RCF耐用性較為重要的因素之一。例如,對(duì)于4個(gè)相同丹參酮類(lèi)成分的檢測(cè),吳笛等用Waters、戴安的儀器及4根不同廠家的色譜柱,選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為248nm,李倩等用Waters、島津的儀器及3根不同廠家的色譜柱,選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為255nm,相同成分的RCF差異較大(RSD>5%);在麥貞花顆粒不同成分的測(cè)定中,僅使用230nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)CF重現(xiàn)性差(RSD>5%),采用變波長(zhǎng)檢測(cè):0~15min選擇403nm檢測(cè)羥基紅花黃色素A、特女貞苷,15~45min選擇230nm檢測(cè)蘆丁,得到的CF重現(xiàn)性良好(RSD≤3%)。另外,色譜條件中的柱溫、流速、進(jìn)樣體積等因素對(duì)CF也有一定的影響。實(shí)驗(yàn)研究中固定這些色譜參數(shù)的設(shè)置,能將系統(tǒng)影響誤差降到最小。2.2檢測(cè)峰定位的影響因素由于只有內(nèi)參物的對(duì)照品無(wú)其他成分的對(duì)照品,無(wú)法直接指認(rèn)其他待測(cè)成分,因此如何僅用內(nèi)參物定位其他待測(cè)成分是QAMS需要解決的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。峰定位方法主要分為兩種:(1)待測(cè)成分與內(nèi)參物的保留時(shí)間差值;(2)待測(cè)成分與內(nèi)參物的保留時(shí)間比值。通常通過(guò)比較兩種峰定位方法的耐用性,選擇RSD值較小的作為定位依據(jù),有時(shí)會(huì)輔以各個(gè)成分的紫外吸收特征,以便更準(zhǔn)確地對(duì)色譜峰進(jìn)行定位。峰定位的影響因素主要是不同儀器、不同色譜柱對(duì)各成分保留時(shí)間的影響。如,測(cè)定復(fù)方丹參片中的4個(gè)丹參酮成分時(shí),不同色譜柱上的隱丹參酮、丹參酮Ⅰ出峰順序不一致,不能用保留時(shí)間比值或差值進(jìn)行定位,需要根據(jù)峰形及各個(gè)成分的紫外最大吸收波長(zhǎng)來(lái)確認(rèn)目標(biāo)峰。在