黃芪對(duì)表皮干細(xì)胞增殖活性的調(diào)控作用

黃芪對(duì)表皮干細(xì)胞增殖活性的調(diào)控作用

0皮膚表皮干細(xì)胞增殖活性的認(rèn)識(shí)和實(shí)踐嚴(yán)重?zé)齻?、傷口、糖尿病局頭皮炎和腫瘤切除通常會(huì)導(dǎo)致皮膚組織的廣泛缺陷。目前，傳統(tǒng)的臨床治療方法包括異體皮移植或異體皮移植，但自身皮膚的來(lái)源有限。異體皮和異體皮移植仍存在一定的免疫排斥反應(yīng)，傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，以及臨床應(yīng)用的需要。近期研究證實(shí),表皮干細(xì)胞具有自我更新、強(qiáng)大增殖和分化潛能,是皮膚及其附屬器發(fā)生、修復(fù)與重建的關(guān)鍵源泉。凡能提高表皮干細(xì)胞增殖活性的藥物和因素,對(duì)促進(jìn)皮膚傷口愈合均具有重要意義。利用干細(xì)胞技術(shù)修復(fù)創(chuàng)面是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域傷口愈合治療的重要策略,尋找增強(qiáng)皮膚表皮干細(xì)胞增殖活性的安全有效方法尤為必要。黃芪是豆科多年生草本植物膜莢黃芪和蒙古黃芪的根,為中藥中的補(bǔ)氣藥,性溫味甘,入肺、歸脾經(jīng),具有扶正固本、益氣活血、延緩衰老等作用。中國(guó)藥典記載黃芪化學(xué)成分眾多,主要含有皂苷類、黃酮類、多糖類等有效成分,黃芪甲苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下:課題組以往研究發(fā)現(xiàn),黃芪對(duì)人表皮體外擴(kuò)展生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,并能誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞增殖,具有修復(fù)皮膚缺損結(jié)構(gòu)和功能的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討黃芪對(duì)人皮膚表皮干細(xì)胞增殖活性的調(diào)控作用。1人表皮干細(xì)胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)設(shè)計(jì):細(xì)胞學(xué)體外觀察。時(shí)間及地點(diǎn):于2005-09/2008-06在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院完成。材料:燒傷整形患者植皮剩余皮片來(lái)源于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷中心,患者對(duì)實(shí)驗(yàn)知情同意。黃芪注射液為正大青春寶藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號(hào)0207114,是從黃芪中提取的有效成分精制而成,黃色或棕色的澄明液體,pH6.0~7.5,每毫升含黃芪甲苷≥1.0mg,相當(dāng)于含生藥2g。實(shí)驗(yàn)方法:表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng):磷酸鹽緩沖液漂洗皮片,用胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮,制成單細(xì)胞,以含表皮生長(zhǎng)因子5μg/L、角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液組成的表皮干細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮,接種于預(yù)鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)板中,置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育10min,吸出培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組加入含40g/L黃芪的表皮干細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),對(duì)照組單純加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)液?？寺⌒纬陕蕼y(cè)定:將兩組細(xì)胞分別消化分散成單細(xì)胞懸液,按200個(gè)細(xì)胞/孔接種到6孔培養(yǎng)板中,繼續(xù)培養(yǎng)2周后行姬姆薩染色,顯微鏡下觀察,進(jìn)行細(xì)胞克隆計(jì)數(shù),計(jì)算克隆形成率。細(xì)胞周期測(cè)定:將兩組細(xì)胞分別消化成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×109L-1,用體積分?jǐn)?shù)為70%的冷乙醇4℃固定20min,預(yù)冷PBS洗滌,加RNA酶37℃水浴20min,加碘化丙錠染液避光孵育30min,FACSCalibur流式細(xì)胞儀自動(dòng)檢測(cè)細(xì)胞周期。激發(fā)光源為15mW氬離子激光,激發(fā)波長(zhǎng)為488nm。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè):待第2代細(xì)胞形成明顯克隆后,以EnVision兩步法分別行端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶免疫細(xì)胞化學(xué)染色,具體步驟按試劑說(shuō)明書進(jìn)行。同時(shí)設(shè)不加一抗的陰性對(duì)照。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)定量分析:取兩組細(xì)胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶免疫細(xì)胞化學(xué)染色玻片各3張,采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,去除背景著色,每張玻片隨機(jī)選取5個(gè)視野,測(cè)定其吸光度和陽(yáng)性細(xì)胞面積,取其平均吸光度值(以A表示)和陽(yáng)性面積值(以S表示)。主要觀察指標(biāo):(1)表皮干細(xì)胞的增殖、克隆及細(xì)胞周期。(2)人表皮干細(xì)胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果及其表達(dá)定量分析。設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者:設(shè)計(jì)和評(píng)估為第一作者,干預(yù)實(shí)施為全部作者。均經(jīng)過(guò)系統(tǒng)培訓(xùn),未使用盲法評(píng)估。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:由第一作者用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,計(jì)量資料以表示,兩樣本均數(shù)比較行t檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有顯著性意義,P<0.01為差異有非常顯著性意義。2結(jié)果2.1細(xì)胞克隆形成篩選培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),3~5d后形成小克隆,10d左右有大的細(xì)胞克隆形成,見圖1,2。含黃芪的實(shí)驗(yàn)組人表皮干細(xì)胞克隆形成率明顯高于對(duì)照組,見表1。2.2細(xì)胞周期分析2.3人類表面干旱酶反應(yīng)培養(yǎng)酶的化學(xué)染色結(jié)果2.4人類表面干旱酶反轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)分析圖像定量分析法檢測(cè)結(jié)果顯示,含黃芪的實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值和陽(yáng)性面積值均明顯高于對(duì)照組,見表3。3黃山胞菌細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果克隆形成率和G0/G1期細(xì)胞比例是干細(xì)胞特性的重要要標(biāo)標(biāo)志志。。實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)結(jié)果果顯顯示示,,含含黃黃芪芪的的實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)組組人人表表皮皮干干細(xì)細(xì)胞胞克隆形成率和G0/G1期細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組,提示黃芪有助于維持人皮膚表皮干細(xì)胞的特性。近期研究發(fā)現(xiàn),表皮干細(xì)胞在體外壽命短暫,很容易失去干細(xì)胞特性而發(fā)生終末分化。如果能夠在體外較好地調(diào)控表皮干細(xì)胞的增殖分化,維持其干細(xì)胞特性,延長(zhǎng)其壽命,則對(duì)于創(chuàng)面修復(fù)和構(gòu)建組織工程皮膚具有重要意義。細(xì)胞的衰老和老化被認(rèn)為和染色體末端由重復(fù)的DNA(TTAGGG)序列所組成的端粒序列丟失相關(guān)。隨著細(xì)胞的每次分裂,端粒會(huì)丟失50~200bp,當(dāng)端?？s短到一定程度就不再保護(hù)染色體免受重組或降解,細(xì)胞分裂的控制點(diǎn)就此得到信號(hào)而產(chǎn)生作用,可使細(xì)胞分裂停止并進(jìn)入老化過(guò)程,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。端粒長(zhǎng)度的維持即重復(fù)序列向染色體末端的添加由端粒酶所催化。端粒酶組成包括:RNA組分、端粒酶相關(guān)蛋白和端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶,其中端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)端粒酶活性起關(guān)鍵作用。在人體,端粒酶活性存在于干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、部分有再生能力的體細(xì)胞及絕大多數(shù)惡性腫瘤組織中。它的高活性是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的一項(xiàng)重要條件,但其適量表達(dá)又具有延長(zhǎng)細(xì)胞壽命的作用[21,22,23,24,25,26,27,28,29]。隨著干細(xì)胞分化的進(jìn)行,端粒酶活性也隨之降低,至終末分化細(xì)胞已無(wú)法測(cè)到端粒酶。適度上調(diào)和維持干細(xì)胞的端粒酶活性,對(duì)提高干細(xì)胞體外復(fù)制和擴(kuò)增能力具有重要意義。實(shí)驗(yàn)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,含黃芪的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)均呈陽(yáng)性,圖像分析顯示含黃芪的實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值和陽(yáng)性面積值明顯高于對(duì)照組。初步研究結(jié)果表明黃芪可有效增強(qiáng)人皮膚表皮干細(xì)胞端粒酶反