高脂血癥小鼠模型的建立及降血脂保健食品功能檢測(cè)研究

高脂血癥小鼠模型的建立及降血脂保健食品功能檢測(cè)研究

在19世紀(jì)，人們的生活水平顯著提高。同時(shí)，與生活方式相關(guān)的疾病已成為威脅人類健康的主要原因。在我國(guó)心腦血管疾病的死亡率已經(jīng)上升到第二位。高血脂癥,即血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的增高是引起心腦血管疾病的一個(gè)主要原因。大量的流行病學(xué)調(diào)查和研究均表明,高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、冠心病(CHD)、高血壓、糖尿病、膽石癥等多種疾病的重要危險(xiǎn)因素,嚴(yán)重危害人類健康。因此,研究能夠調(diào)節(jié)血脂的保健食品對(duì)預(yù)防疾病,保護(hù)人民身體健康有重要的意義[1～5]。然而,在高血脂癥的機(jī)制研究、新型保健食品開(kāi)發(fā)及新藥研究中,都需要快捷、準(zhǔn)確、質(zhì)量穩(wěn)定的高脂血癥動(dòng)物模型。目前制備高脂血癥動(dòng)物模型主要有表面活性劑法、免疫學(xué)法、同型半胱氨酸法、轉(zhuǎn)基因法及高脂飼料喂養(yǎng)法等等。其中高脂飼料喂養(yǎng)法由于其簡(jiǎn)便易行是目前國(guó)內(nèi)建立高血脂動(dòng)物模型的常用方法。由于大鼠代謝較穩(wěn)定,且血量充足,造成高血脂動(dòng)物模型的成功率高,因此在降血脂保健食品研究中通常采用大鼠制備高血脂模型。但是飼養(yǎng)大鼠占地面積大,所用高脂飼料消耗多。如果用小鼠代替大鼠,飼養(yǎng)經(jīng)費(fèi)能夠節(jié)省約2/3,且動(dòng)物房使用面積能夠節(jié)省約4/5。由于小鼠的代謝情況與大鼠有很大不同,能否用小鼠建立起穩(wěn)定的高血脂模型,進(jìn)而代替大鼠進(jìn)行降血脂保健食品功能評(píng)價(jià)研究是本課題要解決的問(wèn)題。為此,我們采用高脂飼料喂養(yǎng)法,觀察小鼠進(jìn)食高脂飼料60d內(nèi)血脂變化情況,觀察比較兩種降血脂保健食品對(duì)高血脂小鼠和高血脂大鼠血脂各項(xiàng)指標(biāo)的影響,從而對(duì)高血脂小鼠模型的穩(wěn)定性和在降血脂保健食品功能檢測(cè)研究中的實(shí)用性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。1材料和方法1.1動(dòng)物及微生物選用北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司繁殖的健康清潔級(jí)21～26g昆明種雄性小鼠72只,150～200gWistar雄性大鼠48只[許可證號(hào):SCXK-(京)2002-0003]。1.2儀器和試劑1.2.1儀器755型分光光度計(jì);恒溫水浴鍋;離心機(jī);攪拌器。1.2.2中生北控生物技術(shù)總膽固醇試劑盒中生北控生物技術(shù)股份有限公司;甘油三酯試劑盒中生北控生物技術(shù)股份有限公司;高密度脂蛋白膽固醇試劑盒中生北控生物技術(shù)股份有限公司。1.3降血脂飲食功能紅曲醋1號(hào)義烏丹溪酒業(yè)有限公司;功能紅曲醋2號(hào)義烏丹溪酒業(yè)有限公司。2結(jié)果與分析2.1脂肪狗模型的制備和穩(wěn)定性的觀察2.1.1動(dòng)物分組及處理小鼠給予正?；A(chǔ)飼料7d后,眼眶取血,分離血清,測(cè)定血清中總膽固醇(TC),甘油三脂(TG)。根據(jù)TC水平隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照組和高脂模型組,每組12只。高脂模型組進(jìn)食高脂飼料(78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽)。正常對(duì)照組進(jìn)食正常基礎(chǔ)飼料。兩組動(dòng)物均飲用自來(lái)水(經(jīng)紫外消毒)。在喂養(yǎng)過(guò)程中的30、45、60d,分別從正常對(duì)照組小鼠和高脂模型組小鼠眼眶取血,測(cè)定TC和TG。2.1.2高脂飼料對(duì)小鼠血清總膽固醇的影響由表1可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)前高脂模型組小鼠血清總膽固醇與正常對(duì)照組比較,差異無(wú)顯著性(p>0.05)。正常對(duì)照組小鼠實(shí)驗(yàn)第30、45和60d,與本組實(shí)驗(yàn)前比較,血清總膽固醇無(wú)顯著性差異(p>0.05)。而飼喂高脂飼料的小鼠實(shí)驗(yàn)第30d與本組實(shí)驗(yàn)前比較,血清總膽固醇顯著升高(p<0.05);實(shí)驗(yàn)第30、45和60d,飼喂高脂飼料的小鼠其血清總膽固醇水平顯著高于正常對(duì)照組。從表1中還可以看到,進(jìn)食高脂飼料30～60d,高脂模型組小鼠血清總膽固醇始終維持在一個(gè)高的水平上?？梢?jiàn),在喂食小鼠高脂飼料第30d,小鼠TC就有明顯升高,且在造成高膽固醇動(dòng)物模型之后的30d內(nèi)能繼續(xù)維持。2.1.3高脂模型小鼠血清酯類基因型的影響由表2可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)前高脂模型組小鼠血清TG與正常對(duì)照組比較,差異無(wú)顯著性(p>0.05)。正常對(duì)照組小鼠飼喂正常基礎(chǔ)飼料60d中,血清甘油三酯無(wú)顯著性變化,一直處于本組實(shí)驗(yàn)前的水平(p>0.05)。而飼喂小鼠高脂飼料30d后,與實(shí)驗(yàn)前比較,高脂模型組小鼠血清甘油三酯顯著升高(p<0.01);而在造成高甘油三酯動(dòng)物模型后的30d當(dāng)中,高脂模型組小鼠血清甘油三酯仍能繼續(xù)維持在這個(gè)高水平上。綜合表1和表2的結(jié)果可知,給小鼠飼喂高脂飼料30d可以造成高血脂模型,在繼續(xù)飼喂高脂飼料30d里,觀察到此高血脂模型能夠繼續(xù)維持。2.2脂肪狗模型的實(shí)用性和可行性的評(píng)價(jià)2.2.1功能紅曲醋小鼠血脂指標(biāo)變化給予小鼠正常基礎(chǔ)飼料7d后,禁食12h,眼眶取血,分離血清,測(cè)定血清中TC、TG和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。根據(jù)TC水平將小鼠分為四組:正常對(duì)照組﹑高脂對(duì)照組﹑功能紅曲醋1號(hào)組﹑功能紅曲醋2號(hào)組,每組12只。功能紅曲醋1號(hào)組﹑功能紅曲醋2號(hào)組飼喂高脂飼料(78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽),同時(shí)每日一次灌胃按1:4(醋:水)稀釋的功能紅曲醋,小鼠灌胃體積為0.2ml/10gbw。高脂對(duì)照組飼喂高脂飼料,正常對(duì)照組飼喂正常基礎(chǔ)飼料,高脂對(duì)照組和正常對(duì)照組每日一次灌胃與功能紅曲醋組同體積的自來(lái)水(經(jīng)紫外消毒)。連續(xù)給予受試物53d后禁食12h,測(cè)定各組動(dòng)物血脂三項(xiàng)指標(biāo),用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)。由表3可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)前功能紅曲醋1、2號(hào)組小鼠TC與高脂對(duì)照組比較,差異均無(wú)顯著性(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)53d后,高脂對(duì)照組與本組實(shí)驗(yàn)前比較TC含量顯著升高,表明小鼠高TC模型制備成功。此時(shí)灌胃功能紅曲醋53d的2號(hào)組小鼠血清TC含量顯著低于高脂對(duì)照組(p<0.05),表明功能紅曲醋2號(hào)具有降低血清總膽固醇含量的作用。從表3中還可以看到,實(shí)驗(yàn)前功能紅曲醋1、2號(hào)組小鼠TG與高脂對(duì)照組比較,差異均無(wú)顯著性(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)53d后,高脂對(duì)照組與本組實(shí)驗(yàn)前比較TG含量顯著升高,表明小鼠高TG模型制備成功。此時(shí)灌胃功能紅曲醋53d的1、2號(hào)組小鼠血清TG含量均顯著低于高脂對(duì)照組(p<0.05),表明功能紅曲醋1、2號(hào)均具有降低血清甘油三酯含量的作用。從表3中還可知,給予小鼠相同劑量的功能紅曲醋53d后,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組血清HDL-C與高脂對(duì)照組比較均無(wú)顯著變化(p<>0.05)。表明功能紅曲醋1、2號(hào)對(duì)高血脂小鼠HDL-C含量無(wú)顯著影響。2.2.2小鼠血脂指標(biāo)的測(cè)定動(dòng)物分組及飼喂情況同2.2.1。功能紅曲醋1號(hào)組、功能紅曲醋2號(hào)組每日一次灌胃按1:4(醋:水)稀釋的功能紅曲醋,大鼠灌胃體積為1ml/100gbw,高脂模型組和正常對(duì)照組每日一次灌胃與功能紅曲醋組同體積的水。連續(xù)給予受試物53d后禁食12h,測(cè)定各組動(dòng)物血脂三項(xiàng)指標(biāo)。由表4可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)前,功能紅曲醋1,2號(hào)組大鼠TC、TG、HDL-C與高脂對(duì)照組比較,差異均無(wú)顯著性(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)53d后,高脂對(duì)照組與本組實(shí)驗(yàn)前比較TC、TG含量顯著升高,表明高脂模型制備成功。此時(shí)灌胃功能紅曲醋53d的2號(hào)組大鼠血清TC含量顯著低于高脂對(duì)照組(p<0.05),表明功能紅曲醋2號(hào)具有降低血清總膽固醇含量的作用。灌胃功能紅曲醋53d的1、2號(hào)組大鼠血清TG含量均顯著低于高脂對(duì)照組(p<0.05),表明功能紅曲醋1、2號(hào)均具有降低血清甘油三酯的作用。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組與高脂模型組比較,功能紅曲醋1、2號(hào)組大鼠血清HDL-C差異均無(wú)顯著性(p>0.05)。說(shuō)明功能紅曲醋1、2號(hào)對(duì)高血脂大鼠HDL-C無(wú)顯著影響。2.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的結(jié)論與用小鼠為實(shí)驗(yàn)材料所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論相一致。3不同降血脂保健功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)大的結(jié)果分析據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國(guó)近年來(lái)心腦血管疾病占我國(guó)居民總死亡原因39.4%。而這些心血管疾病,絕大多數(shù)是由于高血脂導(dǎo)致的動(dòng)脈硬化而引起的。因此,如何能找到一種有效的保健食品,在人們?nèi)粘ｏ嬍车倪^(guò)程中就可以起到對(duì)血脂的控制、對(duì)心腦血管的保護(hù)已經(jīng)成為本世紀(jì)保健食品領(lǐng)域的重大研究熱點(diǎn)。然而,任何一種保健食品在上市前,都要經(jīng)過(guò)多次動(dòng)物實(shí)驗(yàn),不斷探索出最合適的配方及生產(chǎn)工藝,這就需要首先建立高血脂動(dòng)物模型。用大鼠為實(shí)驗(yàn)材料做這些前期工作無(wú)疑要花費(fèi)大量的經(jīng)費(fèi),如果能用小鼠代替大鼠做保健品的前期配方篩選工作既可減少經(jīng)費(fèi)又能節(jié)省空間。對(duì)于降血脂保健食品功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn),如果用小鼠取代大鼠,存在三個(gè)要解決的問(wèn)題。一是在降血脂保健食品功能評(píng)價(jià)研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,測(cè)定規(guī)定的血脂三項(xiàng)指標(biāo),用常規(guī)的試劑盒方法,每只動(dòng)物的最少采血量也需要500μl。用大鼠為實(shí)驗(yàn)材料勉強(qiáng)可行,而以小鼠為實(shí)驗(yàn)材料就會(huì)出現(xiàn)采血量過(guò)大導(dǎo)致動(dòng)物失血過(guò)多的問(wèn)題。這一問(wèn)題在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)得到解決。第二個(gè)問(wèn)題是小鼠高血脂模型建立成功后在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間是否穩(wěn)定。盡管目前有一些用小鼠為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行保健食品降血脂功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的報(bào)道,在這些報(bào)道中也都建立了小鼠的高血脂模型,但很少有關(guān)于高血脂模型建立后是否能夠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間穩(wěn)定的研究報(bào)道。小鼠代謝情況與大鼠有很大差別,如果實(shí)驗(yàn)中建立的小鼠高血脂模型在給予受試物階段不穩(wěn)定,就會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)很大誤差。因此本文研究了在本實(shí)驗(yàn)條件下所建立的小鼠高血脂動(dòng)物模型的穩(wěn)定情況。從表1的結(jié)果可以看到,給小鼠飼喂高脂飼料30d后,與本組實(shí)驗(yàn)前及與對(duì)照組比較,小鼠血清TC和TG含量顯著升高(p<0.05);而在造成高血脂動(dòng)物模型后的30d當(dāng)中,高脂模型組小鼠血清TC和TG含量一直能夠維持在這個(gè)高水平上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明用本實(shí)驗(yàn)方法所建立起來(lái)的小鼠高血脂模型在進(jìn)行保健食品降血脂功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)期間是穩(wěn)定的。第三個(gè)問(wèn)題是用小鼠為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行降血脂保健食品功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn),其結(jié)果是否與用大鼠進(jìn)行同一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。表3、4的結(jié)果,是大鼠與小鼠在同一時(shí)間,在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,分別灌喂相同兩種受試物后所得到的結(jié)果。這兩個(gè)表的結(jié)果相比較,特別是兩個(gè)實(shí)驗(yàn)所得出的結(jié)論相比較可以看到也是一致的。因此這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了在降血脂保健食品功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中用小鼠代替大鼠基本上是可行的。用大鼠進(jìn)