高尿酸血癥模型的復(fù)制方法

高尿酸血癥模型的復(fù)制方法

動(dòng)脈粥樣硬化（hypericvision）是指細(xì)胞外液中的鈉胺呈現(xiàn)過度飽和狀態(tài)。一般認(rèn)為，血液中的尿酸鹽417moll-1應(yīng)考慮高尿酸血癥。超高蛋白膳食是引起嘌呤代謝紊亂的重要原因,過量糖、脂肪、蛋白質(zhì)、鹽的攝入及大量飲酒與患病率增加有重要關(guān)系。隨著人民生活水平的進(jìn)一步提高,高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)病率逐漸上升。國(guó)內(nèi)21家城市醫(yī)院1979~1993年間住院的痛風(fēng)病人數(shù)直線上升,南方的上升趨勢(shì)比北方更明顯。約5%~12%高尿酸血癥患者會(huì)發(fā)展成為痛風(fēng),痛風(fēng)不僅可以侵犯骨和關(guān)節(jié),而且還容易累及腎臟和心血管系統(tǒng)。高尿酸血癥及原發(fā)性痛風(fēng)與肥胖癥、高脂血癥、高血壓病、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病呈顯著正相關(guān)。尿酸可以促進(jìn)血小板聚集,誘發(fā)血栓形成,高尿酸血癥是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素,心腦血管病伴發(fā)高尿酸血癥的患者易誘發(fā)急性心肌梗死、中風(fēng),使病死率增高。因此痛風(fēng)和糖尿病一樣,是危害人類健康的一種嚴(yán)重的代謝性疾病。為了建立一種穩(wěn)定持久的高尿酸血癥的動(dòng)物模型,不少學(xué)者在這一方面做了探索性的研究并取得了一定成果。本文綜述高尿酸血癥動(dòng)物模型制備的研究進(jìn)展。1血卟啉代謝與鈉胺消除1.1代謝前體及代謝速度變化人體的尿酸有兩個(gè)來源,由體內(nèi)氨基酸、核苷酸及其他小分子化合物合成尿酸,或核酸分解代謝產(chǎn)生尿酸(內(nèi)源性),約占體內(nèi)總尿酸的80%。從富含嘌呤或核蛋白的食物中核苷酸分解而來(外源性),約占體內(nèi)總尿酸的20%。對(duì)高尿酸血癥的發(fā)生,內(nèi)源性代謝紊亂較外源性因素更重要。嘌呤主要來自細(xì)胞代謝分解的核酸和其它嘌呤類化合物以及食物。次黃嘌呤和黃嘌呤是尿酸的直接前體,在黃嘌呤氧化酶作用下,次黃嘌呤氧化為黃嘌呤,黃嘌呤氧化為尿酸。參與尿酸代謝的嘌呤核苷酸有IMP、AMP以及GMP3種。次黃嘌呤在次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)催化下轉(zhuǎn)變?yōu)镮MP。嘌呤代謝速度受5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)和谷氨酰胺的量以及GMP、AMP和IMP對(duì)酶的負(fù)反饋抑制的調(diào)節(jié)。人類尿酸生成的速度主要決定于細(xì)胞內(nèi)PRPP濃度,而PRPP合成酶、HGPRT、磷酸核糖焦磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶以及黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase)為其中重要的酶,而磷酸核糖焦磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶為限速反應(yīng)酶。1.2血尿酸酶檢測(cè)正常人體內(nèi)尿酸池平均為1200mg,每天產(chǎn)生750mg,排出500~1000mg。70%的尿酸經(jīng)腎臟排泄,30%經(jīng)膽道和腸道排泄。人和猿類缺乏尿酸酶,后者可使尿酸分解成尿囊素,據(jù)推測(cè)人和猿類是在進(jìn)化過程中經(jīng)過基因突變的自然選擇,失去了編碼尿酸酶的功能基因,人類血尿酸水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他攜帶尿酸酶的物種。因此,嘌呤合成代謝增強(qiáng)及(或)尿酸排泄減少是痛風(fēng)患者血清尿酸增高的原發(fā)機(jī)制。血液中尿酸的濃度取決于尿酸的生成和排泄之間的平衡。2高尿酸血癥實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型2.1高尿酸血癥形成的機(jī)制是腺體2.1.1腺系磷酸核糖酸藥物代謝和谷酰胺磷酸總酶活性檢測(cè)腺嘌呤是一種含氮雜環(huán)嘌呤類化合物,給大量腺嘌呤后,磷酸核糖焦磷酸和谷酰胺增加,體內(nèi)谷酰胺磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤氧化酶活性增加,尿酸合成加速,增加血中尿酸含量。2.1.2方法(1)血尿酸水平變化SD大鼠或Wistar大鼠,腺嘌呤2、4g·kg-1灌胃給藥,d3大鼠血尿酸水平開始升高,d7明顯升高,d10降低,同時(shí)出現(xiàn)腎功能損害。周小舟等以腺嘌呤300mg·kg-1灌胃,連續(xù)21d,大鼠血尿酸明顯升高并出現(xiàn)慢性腎功能衰竭。(2)g-1的飼料1mon齡雞分別以含腺嘌呤2、4、6g·kg-1的飼料飼喂,每只雞每日予上述飼料20g,不足部分予常規(guī)飼料。4、6g·kg-1組雞于第3wk血尿酸水平升高,且持續(xù)穩(wěn)定升高8wk以上。(3)灌胃對(duì)d5血清尿酸水平和黃芐呤氧化酶活性的影響迪法克品系鵪鶉,♂,體重170~190g,以腺嘌呤300、150mg·kg-1·d-1灌胃給藥,d5血清尿酸水平明顯升高,10~15d仍維持較高水平,血清黃嘌呤氧化酶活性明顯升高,而腎功能和體重未見明顯變化。2.2高血流失的母親與高血流失的機(jī)理2.2.1黃系的氨基酸類酵母含有豐富的蛋白質(zhì)、核苷酸、B族維生素等。在體內(nèi)充分水解能產(chǎn)生含氮的有機(jī)堿(包括嘌呤堿類、嘧啶堿類)和磷酸,大劑量的酵母進(jìn)入體內(nèi)后,能干擾機(jī)體正常的嘌呤代謝,致嘌呤代謝紊亂,其主要表現(xiàn)為黃嘌呤氧化酶活性增加,尿酸生成加速。2.2.2方法(1)灌胃12wk酵母膏灌胃可以復(fù)制出小鼠高尿酸血癥模型,以15~30g·kg-1·d-1連續(xù)灌胃1~2wk較好。對(duì)照組小鼠血清尿酸為(108.1±13.9)μmol·L-1。(2)血清尿酸水平迪法克鵪鶉,♂,體重180g左右,每天每只予模型飼料15g(內(nèi)含酵母干粉3g),食后補(bǔ)充普通飼料。造模7d時(shí),血清尿酸水平開始升高,14d明顯升高,直至35d血清尿酸水平持續(xù)升高。血清黃嘌呤氧化酶、BUN水平在造模7d時(shí)有一過性明顯升高,14d后恢復(fù)至正常水平。2.3母乳喂養(yǎng)高尿酸血癥的模型2.3.1原則和上面一樣2.3.2大鼠高呤飼料的較大周內(nèi)酶活性SD大鼠,體重(200±20)g,將酵母干粉、腺嘌呤均勻拌入粉碎的大鼠顆粒飼料中,含量分別為10%和0.1%,重新壓粒成型。給予大鼠高嘌呤飼料,酵母、腺嘌呤的進(jìn)食量分別為10g·kg-1、100mg·kg-1。d7大鼠血清尿酸略有升高,d12、d19大鼠血清尿酸、肌酐、尿素氮含量明顯升高,停用高嘌呤飼料后仍繼續(xù)上升,d24時(shí)才開始回落,d52時(shí),與對(duì)照組相比仍差異有顯著性。何力群等將酵母、腺嘌呤、沙丁魚與少量市售粉飼料攪拌均勻后喂大鼠,造模21d后大鼠血尿酸、肌酐、尿素氮都升高。2.4腺石蠟和乙胺醇使大鼠高尿酸血癥模型2.4.1原理腺嘌呤的原理同上,乙胺丁醇、煙酸等可以抑制尿酸排泄,增加尿酸在體內(nèi)的蓄積。2.4.2大鼠血清尿酸水平♂Wistar大鼠,體重(200±10)g,腺嘌呤100mg·kg-1+乙胺丁醇250mg·kg-1灌胃給藥,每日1次,連續(xù)7~21d,大鼠血清尿酸明顯升高。腺嘌呤200mg·kg-1+乙胺丁醇250mg·kg-1劑量組大鼠血尿酸升高明顯,但腎損害較為嚴(yán)重。2.5黃酮-乙酰胺和黃酮-脂肪酸導(dǎo)致高尿酸血癥2.5.1原理給予大劑量嘌呤物質(zhì)后,小鼠體內(nèi)嘌呤含量增加,嘌呤分解代謝增加,尿酸生成增多,同時(shí)使用抑制尿酸排泄的藥物,小鼠的血尿酸水平升高。2.5.2給藥對(duì)小鼠血尿酸水平的影響黃嘌呤600mg·kg-1+乙胺丁醇250mg·kg-1,次黃嘌呤600mg·kg-1+煙酸100mg·kg-1,灌胃給藥,連續(xù)5d,小鼠血尿酸水平升高,以黃嘌呤和乙胺丁醇組更為明顯。2.6腹腔注射黃酮酸鈉導(dǎo)致小鼠高尿酸血癥的模型2.6.1原理直接注射生成尿酸的前體物質(zhì)可以復(fù)制較穩(wěn)定的高尿酸血癥動(dòng)物模型。2.6.2小鼠血清尿酸檢測(cè)昆明種小鼠,體重18~22g,♀♂均用,次黃嘌呤1000mg·kg-1ip,小鼠血清尿酸在給藥0.5h后達(dá)到高峰,4h后降低到一半,高尿酸血癥可維持24h。其中0.5~1h期間,尿酸值已超過血清尿酸值的飽和濃度?！狻嶂g無性別差異。2.7高尿酸血癥的形成2.7.1原理給動(dòng)物注射尿酸或以尿酸灌胃,可致動(dòng)物血尿酸增高。2.7.2方法(1)大鼠高尿酸血癥模型尿酸250mg·kg-1腹腔注射,小鼠血尿酸10min達(dá)到高峰,高尿酸血癥維持4h以上。(2)尿酸水平迪法克品系鵪鶉,♂,體重170~190g,以尿酸(700、350mg·kg-1·d-1)水溶液灌胃,d5血清尿酸水平明顯升高,10~15d仍維持較高水平。而腎功能和體重未見明顯變化。2.8轉(zhuǎn)換劑破壞小鼠尿酸酶基因2.8.1原理大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)存在尿酸酶,可將體內(nèi)的尿酸分解為尿囊素。使小鼠尿酸酶缺乏可致小鼠尿酸排泄減少,血尿酸增高。2.8.2高尿酸特殊基因小鼠的制備通過胚胎干細(xì)胞同源性重組,破壞小鼠尿酸酶基因(EC1.7.3.3),再用基因重組法獲得尿酸酶缺乏的突變小鼠,制成高尿酸血癥模型小鼠。2.9氧化反應(yīng)產(chǎn)生的高尿酸血癥模型2.9.1原理用尿酸酶抑制劑氧嗪酸抑制尿酸酶活性,減少尿酸的分解與排泄,可造成小鼠、大鼠高尿酸血癥模型。2.9.2方法(1)gk-1對(duì)小鼠血尿酸的影響在取血樣前2h用氧嗪酸鉀鹽(potassiumoxonate)300mg·kg-1給小鼠一次性ip,2h后小鼠血尿酸明顯升高。張冰等用高尿酸飼料(尿酸+尿酸抑制劑Oxonicacid)飼喂C57BL/6♂小鼠,3wk后小鼠血尿酸和甘油三酯水平升高,同時(shí)伴隨有腎功能的改變,血清黃嘌呤氧化酶無明顯升高。(2)wk的病因大鼠飼以2%的oxonicacid,并給予低鹽飲食,持續(xù)7wk,可出現(xiàn)輕度高尿酸血癥,同時(shí)血壓升高、入球小動(dòng)脈增厚。Bluestone等給Wistar大鼠飼喂氧嗪酸0.4g·d-1和尿酸0.6g·d-1,3~4wk后,大鼠血尿酸持續(xù)性升高。3討論3.1內(nèi)尿酸形成的基因高尿酸血癥發(fā)生的機(jī)制為尿酸生成增多或腎臟尿酸排泄減少。目前用于高尿酸血癥的模型動(dòng)物主要有大鼠、小鼠、禽類(如雞、鵪鶉等)等。大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)存在尿酸酶,可以將體內(nèi)尿酸進(jìn)一步分解為尿囊素。尿囊素為無毒物質(zhì),水溶性良好,極易隨尿排出體外,很少在體內(nèi)蓄積。靈長(zhǎng)類在進(jìn)化過程中,編碼尿酸酶的基因發(fā)生突變,缺乏尿酸酶(urateoxidase)。尿酸是機(jī)體嘌呤核苷酸代謝的最終產(chǎn)物,僅有很少一部分(約為1/20)被分解為尿囊素、氨等。禽類與人的嘌呤核苷酸代謝途徑相似,缺乏尿酸酶,都以尿酸為終產(chǎn)物排出體外,故選用禽類作為高尿酸血癥動(dòng)物模型能較確切反映體內(nèi)嘌呤核苷酸的代謝水平,還具有高尿酸血癥水平持續(xù)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。目前選用的家禽主要有雞和鵪鶉。3.2高尿酸特殊類型血尿酸確定的依據(jù)在體內(nèi),腺嘌呤核苷→次黃嘌呤核苷→次黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸→尿囊素,尿酸經(jīng)腎小管分泌排出體外。故增加體內(nèi)尿酸、尿酸前體(次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤)的量或抑制腎小管尿酸的分泌均可導(dǎo)致體內(nèi)血尿酸含量的增高導(dǎo)致高尿酸血癥。目前國(guó)內(nèi)外高尿酸血癥模型的復(fù)制方法主要有三種:①給予模型動(dòng)物飼喂、注射嘌呤或尿酸來提高血尿酸的濃度,必要時(shí)給予抑制排泄的藥物;②抑制大鼠或小鼠尿酸酶活性,以減少尿酸的分解;③破壞尿酸酶基因及基因重組法造成小鼠高尿酸血癥,但該方法使半數(shù)以上突變小鼠不能存活4wk以上。腺嘌呤致高尿酸血癥模型易引起腎功能的損害,劑量增大易引起動(dòng)物死亡。腺嘌呤劑量在不同的文獻(xiàn)中相差甚大,可能與腺嘌呤來源、動(dòng)物種屬、給藥方法不同等有關(guān)。但也有可能是劑量計(jì)算有誤。本文作者預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為腺嘌呤100~300mg·kg-1灌胃,在小鼠、大鼠可以復(fù)制出高尿酸血癥模型,劑量再增大出現(xiàn)動(dòng)物死亡。酵母造模類似于人類高蛋白飲食導(dǎo)致嘌呤核苷酸代謝紊亂誘發(fā)的高尿酸血癥,模型穩(wěn)定,動(dòng)物腎功能、體重未見明顯變化。給小鼠腹腔注射次黃嘌呤或尿酸均能成功復(fù)制高尿酸血癥動(dòng)物模型。這兩種模型簡(jiǎn)便可靠易行,但尚不能形成穩(wěn)定持久的高尿酸血癥,不利于觀察藥物對(duì)高尿酸血癥的治療作用,也不能進(jìn)一步探討高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制。直接使用尿酸以及用尿酸酶抑制劑阻斷尿酸的代謝從而使血尿酸升高,與臨床上高尿酸血癥的發(fā)病病因存在很大的差距。使用乙胺丁醇、煙酸等抑制尿酸排泄,增加尿酸在體內(nèi)的蓄積等方法,與臨床上的原發(fā)性高尿酸血癥有較大的差異。Stavric等報(bào)道,給狗、家兔、大鼠大劑量的尿酸后,由于這些動(dòng)物體內(nèi)肝臟尿酸酶的作用,不能形成持續(xù)穩(wěn)定的高尿酸血癥。用氧嗪酸鉀鹽抑制肝臟尿酸酶活性,在大鼠、家兔、雜種犬、小鼠、豬可形成持續(xù)的高尿酸血癥模型。氧嗪酸不是理想的尿酸酶抑制劑,因?yàn)檩^快地從體內(nèi)清除,Oxonicacid及其鹽是外源性物質(zhì),可以干擾體內(nèi)某些物質(zhì)代謝。造模時(shí)飼喂給藥,由于個(gè)體間食量不均,且在造模的過程中,機(jī)體機(jī)能損害逐漸加重,食量明顯減少,測(cè)得的血尿酸水平不穩(wěn)定。灌胃比進(jìn)食效果好,避免了由于攝入含藥飼料不均而致的血尿酸變化不均勻。大鼠、小鼠血尿酸水平,在高尿酸形成后,繼續(xù)給造模劑血尿酸反而降低。可能與大鼠、小鼠腎臟具有強(qiáng)大排泄尿酸能力,多生成的尿酸通過腎臟排出體外,其