硫化氫對低氧性肺血管重塑大鼠、型膠原mrna表達(dá)的影響

硫化氫對低氧性肺血管重塑大鼠、型膠原mrna表達(dá)的影響

肺血管重建是重要的低氧化性動(dòng)脈高壓（hph）的病理基礎(chǔ)。核電站重建是低氧化性肺血管重建的主要內(nèi)容之一。對其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究是該領(lǐng)域的中心主題。以往人們認(rèn)為硫化氫(H2S)為毒性廢氣,最近我們發(fā)現(xiàn),H2S在心血管系統(tǒng)可內(nèi)源性生成,并具有重要的生理及病理學(xué)效應(yīng),提出H2S是心肺血管功能調(diào)節(jié)的新型氣體信號分子,對低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓和肺血管重塑有明顯的緩解作用。本組研究以HPH大鼠為研究對象,觀察H2S對大鼠肺血管壁Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成的影響,進(jìn)一步探討H2S緩解低氧性肺血管重塑的作用機(jī)制。材料和方法一、低氧和低氧+nahs對大鼠的mic本組實(shí)驗(yàn)得到北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)及倫理委員會的許可。健康雄性Wistar大鼠(首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)19只,體重180~200g,隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為:對照組(6只),低氧組(7只),低氧+硫氫化鈉(NaHS)組(6只)。參照薛全福等方法進(jìn)行:低氧艙有縫隙與外界大氣相通,可供艙內(nèi)氣體緩慢進(jìn)出,使艙內(nèi)氣壓與大氣壓始終保持平衡;進(jìn)行低氧處理時(shí),將大鼠放入低氧艙內(nèi),向艙內(nèi)通入氮?dú)?替換艙內(nèi)的部分氧氣,從而使艙內(nèi)氧濃度下降;艙內(nèi)混合氣體用小風(fēng)扇不斷混勻,用氧濃度監(jiān)測儀(RSS-5100型,上海雷磁公司)隨時(shí)監(jiān)測艙內(nèi)的氧濃度;通過調(diào)節(jié)減壓閥和氣體流量表控制注入艙內(nèi)的氮?dú)饬髁?使艙內(nèi)氧濃度保持在(10.0±0.5)%。將低氧組和低氧+NaHS組大鼠置于常壓低氧艙內(nèi)(10%O2、90%N2),每次連續(xù)低氧6h(10∶00~16∶00),每天低氧處理1次,共持續(xù)21d。對低氧+NaHS組大鼠每天低氧前腹腔注射H2S供體NaHS溶液(14μmol/kg,每次使用前新鮮配制);低氧組及對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。3組大鼠飲食及飲水條件相同。二、動(dòng)脈和頸動(dòng)脈插管測量低氧結(jié)束后,給大鼠腹腔注射烏拉坦1.2g/kg體重麻醉,肺動(dòng)脈插管測定肺動(dòng)脈平均壓(mPAP),頸動(dòng)脈插管測定體循環(huán)平均壓(mAP)。打開胸腔取出心臟,分別稱量右心室(RV)和左心室+室間隔(LV+SP)重量。計(jì)算RV/(LV+SP)。三、對苯二胺鹽酸鹽分光光度法檢測對苯二胺鹽酸鹽上清液的吸收劑ab的活性采用亞甲藍(lán)分光光度法。在試管中加入0.5ml1%醋酸鋅,然后加入0.1ml血漿標(biāo)本混勻,再加入0.5ml20mmol/L對苯二胺鹽酸鹽和0.5ml30mmol/L三氯化鐵,室溫孵育20min。再加入1ml10%三氯醋酸沉淀蛋白,加2.5ml蒸餾水補(bǔ)足體積至5ml。離心5min,吸出上清液,在670nm處檢測上清液的吸光度(A)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中H2S含量。四、肺組織中和型膠原的檢測1.i型和ii型膠原免疫組化Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化試劑盒均購自天津TBD公司。參照說明書進(jìn)行。2.i型和ii型前膠原mrna的原位置混合Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA原位雜交試劑盒購自武漢博士德公司,參照說明書進(jìn)行。3.肺血管壁型和型膠原表達(dá)強(qiáng)度的變化光學(xué)顯微鏡下,棕黃色顆粒為陽性信號。參照齊建光等方法,采用半定量積分的方法對肺血管壁的Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行分析。每張切片中的肺小型肌性動(dòng)脈(外徑<50μm)和肺中型肌性動(dòng)脈(外徑約50~150μm)隨機(jī)各檢測10條。五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,采用單因素方差分析(ANOVA)對多組數(shù)據(jù)進(jìn)行均數(shù)比較,進(jìn)一步做組間比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。結(jié)果一、低氧和nahs對大鼠mpap的影響3組大鼠mPAP、RV/(LV+SP)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01,表1)。與對照組相比,低氧組大鼠mPAP升高46%(P<0.01);并伴有右心室肥厚,RV/(LV+SP)增加41%(P<0.01)。與低氧組相比,低氧+NaHS組大鼠的mPAP降低31%;RV/(LV+SP)減少24%(P<0.01)。二、s-l-mf含量血漿H2S含量在3組大鼠之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.93,P<0.01)。與對照組H2S含量[(302±32)μmol/L]比較,低氧組[(192±22)μmol/L]顯著下降36%(P<0.01);與低氧組比較,低氧+NaHS組[(317±36)μmol/L]顯著升高65%(P<0.01)。三、動(dòng)脈中型膠原及其前膠原的mrna顯示1.小型肌性動(dòng)脈型膠原蛋白表達(dá)增加肺小型和中型肌性動(dòng)脈管壁Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)在3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。低氧組肺小型肌性動(dòng)脈Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)較對照組增加81%(P<0.01);而低氧+NaHS組較低氧組減少了32%(P<0.01)。低氧組肺中型肌性動(dòng)脈Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)較對照組增加62%(P<0.01);而低氧+NaHS組較低氧組減少18%(P<0.01)。2.低氧+nahs對小鼠肺小型肌性動(dòng)脈型前膠原mrna表達(dá)的影響Ⅰ型前膠原mRNA在肺小型和中型肌性動(dòng)脈中的表達(dá)在3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。低氧組肺小型肌性動(dòng)脈Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)較對照組增加49%(P<0.01);而低氧+NaHS組較低氧組減少31%(P<0.01)。低氧組肺中型肌性動(dòng)脈中Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)較對照組增加68%(P<0.01);而低氧+NaHS組較低氧組減少33%(P<0.01)。四、動(dòng)脈內(nèi)塌陷型及其前膠原mrna顯示1.不同氧處理對肺小型肌性動(dòng)脈型膠原蛋白表達(dá)的影響肺小型、中型肌性動(dòng)脈Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)在3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。低氧組肺小型肌性動(dòng)脈中Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)較對照組增加84%(P<0.01);而低氧+NaHS組較低氧組減少了37%(P<0.01)。低氧組肺中型肌性動(dòng)脈Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)較對照組增加38%(P<0.01);但是低氧+NaHS組與低氧組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.兩組小鼠血清中前膠原mrna表達(dá)比較Ⅲ型前膠原mRNA在肺小型和中型肌性動(dòng)脈中的表達(dá)在3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。低氧組肺小型和中型肌性動(dòng)脈Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)較對照組分別增加53%和17%(P<0.01);而低氧+NaHS組較低氧組分別減少了45%和33%(P<0.01)。低氧性肺血管重塑的hs和nahs低氧性肺血管重塑既包括中膜平滑肌細(xì)胞的異常增殖,也包括細(xì)胞外基質(zhì)的改變。細(xì)胞外基質(zhì)主要包括膠原蛋白和彈性蛋白。在血管壁中存在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型等不同類型的膠原,其中Ⅰ型膠原與血管壁的韌性和抗張力有關(guān),Ⅲ型膠原與血管壁的彈性有關(guān)。Ⅰ、Ⅲ型膠原是血管壁中不可缺少的主要膠原成分,在維持血管的完整性方面具有重要作用。研究顯示,隨著HPH的形成,大鼠肺動(dòng)脈羥脯氨酸(代表膠原)含量特異性升高,Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)及其前膠原mRNA也有明顯增加。因此,Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白在血管壁的異常沉積是低氧性肺血管重塑的重要病理過程。本組研究證明,經(jīng)3周低氧處理,大鼠血漿H2S水平下降,并形成HPH,表現(xiàn)為mPAP明顯增加,RV/(LV+SP)升高。同時(shí)Ⅰ、Ⅲ型膠原及其前膠原mRNA在肺小動(dòng)脈中的表達(dá)均有明顯增加。迄今為止,低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重塑的形成機(jī)制還不清楚。氣體信號分子如一氧化氮與一氧化碳具有快速產(chǎn)生、迅速彌散、作用廣泛等生物學(xué)特性,它們的發(fā)現(xiàn)將肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制研究帶入了新的階段。以往的研究提示,一氧化氮和一氧化碳在低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重塑中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。然而低氧性肺血管重塑的形成機(jī)制非常復(fù)雜,至今還不明了。在諸多內(nèi)源性生成的氣體分子中,探尋對心肺血管調(diào)節(jié)具有重要作用的新型氣體信號分子并揭示其對肺血管重塑的可能作用機(jī)制是該領(lǐng)域的重大前沿課題。本課題組最近研究發(fā)現(xiàn),H2S可在心血管系統(tǒng)內(nèi)源性生成,提出了H2S為心血管系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)的新型氣體信號分子。H2S的發(fā)現(xiàn)和研究也受到國際上高度關(guān)注。更為重要的是,我們近來發(fā)現(xiàn),在大鼠HPH時(shí),體內(nèi)H2S體系下調(diào);外源性給予H2S供體NaHS后,對低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓和肺血管重塑有明顯的緩解作用。提示H2S在低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重塑中發(fā)揮重要作用。然而它對低氧性肺血管重塑的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。本組研究發(fā)現(xiàn),低氧+NaHS組大鼠血漿H2S水平較低氧組大鼠升高,肺血管壁Ⅰ、Ⅲ型膠原及其前膠原mRNA的表達(dá)較其在低氧組大鼠肺血管中明顯減少,提示H2S對Ⅰ、Ⅲ型膠原在肺血管壁的異常沉積有抑制作用,這可能是H2S緩解低氧性肺血管重塑機(jī)制之一。關(guān)于H2S抑制膠原異常堆積的分子機(jī)制還不清楚,是否與其抑制了肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表