蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展

生物水體的生理活動、病理活動和藥物作用主要由蛋白質(zhì)決定。然而，僅根據(jù)已知的蛋白質(zhì)，我們無法澄清各種復(fù)雜的生命活動的過程。因此，在各組研究的基礎(chǔ)上，以先進(jìn)的技術(shù)為基礎(chǔ)，對生物水體的全部蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和相互作用進(jìn)行了不可避免地研究。目前大量工作者致力于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,本文現(xiàn)對此作一簡述。1蛋白質(zhì)組學(xué)研究是其不斷發(fā)展的必然選擇蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究在特定時間或環(huán)境下某個細(xì)胞或某種組織的基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)的真正含義在于:它不是按照傳統(tǒng)的方式孤立地研究某種蛋白質(zhì)分子的功能,而是應(yīng)用各種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究某種蛋白質(zhì)在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中的功能。蛋白質(zhì)組學(xué)旨在列出全部蛋白質(zhì)的細(xì)目,弄清每一個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能及蛋白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用,對比在疾病和健康狀態(tài)下它們的表達(dá)水平的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)分為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)。前者利用各種先進(jìn)技術(shù)研究蛋白質(zhì)表達(dá)的整體變化,即研究在機(jī)體的生長發(fā)育、疾病和死亡的不同階段中,細(xì)胞與組織的蛋白質(zhì)組分的變化;后者主要通過分離蛋白質(zhì)復(fù)合物系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)間的相互作用。2細(xì)胞生物學(xué)特性為蛋白質(zhì)組測序提供了空間基因是遺傳信息的攜帶者,蛋白質(zhì)則是生命活動的執(zhí)行者。實(shí)際上每一種生命運(yùn)動形式,都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時間和空間出現(xiàn)并發(fā)揮功能的結(jié)果。因而蛋白質(zhì)組研究是我們理解細(xì)胞功能和疾病發(fā)生發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)。如果不能共同致力于蛋白質(zhì)組的研究,那么基因組的研究成果將無法兌現(xiàn)。DNA序列所提供的信息僅僅是一種靜止的資源,而細(xì)胞的生命活動是通過各種蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的一種動態(tài)過程。一個機(jī)體內(nèi)所有不同的細(xì)胞都共享同一基因組,然而同一個機(jī)體的不同細(xì)胞和不同組織卻有不同的蛋白質(zhì)組,而且機(jī)體在不同發(fā)育階段,直至最后消亡的全過程中蛋白質(zhì)組也在不斷變化。因而蛋白質(zhì)組要比基因組復(fù)雜得多。由于對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的選擇性剪切、翻譯起止點(diǎn)的變化或者mRNA上三聯(lián)體密碼發(fā)生移碼突變等均可以明顯促進(jìn)蛋白質(zhì)多樣性的產(chǎn)生,而且mRNA的水平并不能反映蛋白質(zhì)水平,即使一個開放閱讀框(ORF)呈現(xiàn)在面前,也根本無法證實(shí)某種蛋白質(zhì)存在與否。此外,蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的位置、穩(wěn)定性的變化,以及與不同的物質(zhì)如其它蛋白質(zhì)、核酸、脂類等配基相結(jié)合,再加上蛋白質(zhì)具有多種修飾形式,如糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、連接在各種載體上,如小的泛素蛋白等,所有這些均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)組要比基因組復(fù)雜多個數(shù)量級,同時也說明基因的存在和多樣性與蛋白質(zhì)的存在和多樣性之間是不均衡的。因此,利用基因組的研究成果進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)組研究已經(jīng)成為必然。人類基因組測序成功為蛋白組研究奠定了良好基礎(chǔ)。例如,金黃色葡萄球菌病原體的全套基因組測序已經(jīng)完成,通過基因組的信息來研究其蛋白質(zhì)組成將有助于發(fā)現(xiàn)新的抗癌因子、抗生素、工業(yè)催化劑等;1995年流感嗜血桿菌全部基因組測序完成,為支氣管感染的研究提供了蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ),這些工作將會是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要組成部分。3雙向凝膠電泳和雙向高效柱層析的質(zhì)譜分析方法蛋白質(zhì)組研究需要有足夠的技術(shù)支撐,如質(zhì)譜分析(MS),酵母雙雜交系統(tǒng),蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)以及能夠進(jìn)行大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和軟件等。現(xiàn)階段蛋白質(zhì)組的研究可分為3個主要步驟:應(yīng)用雙向凝膠電泳、“雙向”高效柱層析分離蛋白質(zhì);應(yīng)用氨基酸組成分析、C-或N-末端氨基酸序列分析及質(zhì)譜分析鑒定所分離的蛋白質(zhì);應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對鑒定結(jié)果進(jìn)行存儲、處理、對比和分析。3.1雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(two-dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis,2-D電泳)是分離蛋白質(zhì)最基本的工具。其原理是:第一向是等電聚集電泳:用pH值呈梯度排列的凝膠,分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)。第二向是十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PEGE):由于帶負(fù)電荷的SDS可與蛋白質(zhì)多肽鏈結(jié)合,掩蓋了蛋白質(zhì)原有的電荷差別,故可分離分子量不同的蛋白質(zhì)。雙向凝膠電泳不僅用于蛋白質(zhì)的分離,同時也用于蛋白質(zhì)的純化,一張凝膠可分離純化出幾千個甚至上萬個蛋白質(zhì)。目前美國的Proteome公司已開發(fā)了一種全自動化的儀器,灌腔、電泳、染色全部實(shí)現(xiàn)自動化。雙向凝膠電泳技術(shù)存在的問題是不易分離極酸或極堿、極大(>200kD)或極小(<10kD)的蛋白質(zhì),不易檢測低拷貝(<1000拷貝)蛋白質(zhì)或難溶解蛋白質(zhì)。此外,還有三種新的方法可以用作對2-D電泳的補(bǔ)充:帶有同位素的親和性標(biāo)簽標(biāo)記法,二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測量法,毛細(xì)管區(qū)帶電泳。3.2“雙向”高效柱層析“雙向”高效柱層析原理:第一向用分子篩柱層析,按蛋白質(zhì)不同分子量進(jìn)行分離;第二向用反向柱層析,利用蛋白質(zhì)表面疏水性質(zhì)進(jìn)行分離。第二向的分離原理與雙向凝膠電泳中利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分離完全不同,因此兩種方法可相互補(bǔ)充。雙向高效柱層析的優(yōu)點(diǎn):(1)可分離得到較多的蛋白量以供鑒定;(2)可與質(zhì)譜分析聯(lián)用,分離流出的蛋白峰直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。3.3氨基酸組成分析氨基酸組成分析可提供蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)信息。原理是用酸水解蛋白質(zhì),測定蛋白質(zhì)中各氨基酸所占摩爾百分?jǐn)?shù)(%)或各氨基酸的摩爾比率,與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白質(zhì)的理論值進(jìn)行比較。氨基酸組成分析經(jīng)濟(jì)、快速,但靈敏度低。3.4C-或N-端氨基酸序列分析N-端氨基酸序列分析常用Edman降解法測定蛋白質(zhì)N端氨基酸序列,C-端氨基酸序列分析常用羧肽酶法、化學(xué)降解法測定蛋白質(zhì)C端氨基酸序列。目前均可用自動測序儀。N端4個氨基酸殘基序列即可鑒定43%~83%蛋白質(zhì)、C端5個氨基酸殘基序列即可鑒定74%~97%蛋白質(zhì),若兩者結(jié)合使用,判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性會更高。3.5質(zhì)譜分析以往MS僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析,由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn),如:介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化,各種新的質(zhì)譜技術(shù)開始用于生物大分子的分析。其原理是:通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子,然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開來,經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子,確定離子的M/Z值,分析鑒定未知蛋白質(zhì)。質(zhì)譜技術(shù)主要用于檢測雙向凝膠電泳或“雙向”高效柱層析分離所得的蛋白質(zhì)及酶解所得的多肽的質(zhì)量,也可用于蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)間相互作用等方面的研究。三條肽段的精確質(zhì)量數(shù)便可鑒定蛋白質(zhì)。近年來,串聯(lián)質(zhì)譜分析儀發(fā)展迅猛,其數(shù)據(jù)采集方面的自動化程度、檢測的敏感性及效率都大大提高,大規(guī)模數(shù)據(jù)庫和一些分析軟件(如:SEQUEST)的應(yīng)用使得串聯(lián)質(zhì)譜分析儀可以進(jìn)行更大規(guī)模的測序工作。目前,利用2-D電泳及MS技術(shù)對整個酵母細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析,已經(jīng)鑒定出1484種蛋白質(zhì),包括完整的膜蛋白和低豐度的蛋白質(zhì)。3.6酵母雙雜交系統(tǒng)對于研究蛋白質(zhì)間的相互作用,酵母雙雜交系統(tǒng)是非常有力的工具。其基本原理是:由于所有真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子都由兩部分獨(dú)立的功能域組成,即DNA結(jié)合功能域(DNA-BD)和激活功能域(AD)。DNA-BD的作用是與特異的啟動子結(jié)合,AD的作用是引導(dǎo)RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合物,兩者靠近并協(xié)同作用,才能使DNA結(jié)合位點(diǎn)下游的基因得以轉(zhuǎn)錄。如果將待測蛋白之一與DNA-BD融合,蛋白之二與AD融合,若待測的兩種蛋白有相互作用,則DNA-BD和AD靠近并激活報道基因的轉(zhuǎn)錄,借此可研究蛋白質(zhì)間的相互作用。為了大規(guī)模高通量研究蛋白間的相互作用,近年來發(fā)展了一種酵母雙雜交掃描法。首先建立兩類含不同cDNA文庫的酵母菌株,在第一類菌株中,讀碼框(ORF)以DNA-BD融合蛋白形成被表達(dá),在第二類菌株中,ORF以AD融合蛋白形式被表達(dá),將兩類菌株配對,用缺陷的培養(yǎng)基篩選二倍體,只有表達(dá)兩種可以相互作用的蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞才可以在該培養(yǎng)基上生長。該方法的應(yīng)用模式有兩種:一種是微陣列模式,即先將第一類酵母菌(表達(dá)已知蛋白-DNA-BD融合蛋白)克隆在陣列的柵狀網(wǎng)孔內(nèi),以此篩查第二類菌株(表達(dá)待測蛋白-AD融合蛋白),從而確定待測蛋白質(zhì)可與哪一已知蛋白質(zhì)相結(jié)合;另一種是庫篩查模式,即先將一組ORF產(chǎn)生的融合蛋白建成一個庫,而后通過待測蛋白質(zhì)與庫中的蛋白質(zhì)的反應(yīng)尋找可以相互作用某個或某些蛋白質(zhì)。最近,從酵母雙雜交系統(tǒng)衍生出一種新的方法,稱為“反向雙雜交”,主要用于鑒定可以干擾蛋白質(zhì)間相互作用的化合物和多肽。與傳統(tǒng)方式不同,這種方法可以用于開發(fā)在體內(nèi)具有活性的藥物。此外,酵母雙雜交系統(tǒng)的作用已經(jīng)擴(kuò)展至對蛋白質(zhì)的鑒定,通過這種方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與酵母菌mRNA剪接相關(guān)的15種蛋白質(zhì),以及噬菌體T7的55種蛋白質(zhì)、痘苗病毒的226種蛋白質(zhì)、釀酒酵母的5345種蛋白質(zhì)。酵母雙雜交系統(tǒng)提供的蛋白質(zhì)間可能的相互作用的信息,還需通過進(jìn)一步的生物化學(xué)試驗(yàn)加以確定和排除。3.7微陣列技術(shù)嚴(yán)格的講,DNA微陣列技術(shù)并非蛋白質(zhì)組技術(shù)的范疇,但是卻不失為大規(guī)模研究蛋白質(zhì)功能的一種好方法。通常在轉(zhuǎn)錄中受到協(xié)同調(diào)控的基因?qū)⒕幋a同種功能的蛋白質(zhì),如果某一段DNA序列與已知功能的DNA序列在很大程度上相同,說明它們編碼的蛋白質(zhì)的功能也可能相同,例如酵母細(xì)胞中與細(xì)胞分裂周期和芽孢形成相關(guān)的基因可能編碼功能相同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)陣列技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來,蛋白質(zhì)樣品以納升小滴共價吸附在玻璃、硅、塑料等載物片上,每一個載物片可以點(diǎn)10000個樣品,可用于鑒定一個生物有機(jī)體的全部修飾酶。例如:蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)已經(jīng)檢測出酵母中近乎全套的蛋白激酶。3.8生物信息學(xué)4正常及患兒疾病的診斷與治療蛋白質(zhì)組學(xué)可以讓我們對人類疾病的發(fā)病機(jī)制有更加清楚的認(rèn)識。在基因水平檢測基因的突變和多態(tài)性,在蛋白質(zhì)水平分析健康及病變組織不同水平的基因表達(dá),對于疾病的發(fā)病機(jī)制的研究二者均具有重要意義,但對于疾病的診斷治療方面后者更為重要。正常及患病個體的組織、體液中的蛋白質(zhì)分布、特征及差異都是將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于分子診斷學(xué)的基礎(chǔ)。例如:骨髓瘤患者尿液中沉淀物-Bence-Jones蛋白、抗上皮細(xì)胞腫瘤特異性抗體、病變肝細(xì)胞中的p53蛋白均可以作為腫瘤的標(biāo)記,用于腫瘤的診斷。目前,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已發(fā)現(xiàn)許多與癌癥相關(guān)的異常糖基化的蛋白質(zhì),但將這些研究結(jié)果應(yīng)用于臨床診斷其價值尚待評估。對于感染性疾病而言,由于許多微生物的部分或全部基因組的測序工作已經(jīng)完成,這將有助于鑒定該微生物所產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì),以尋找新的診斷標(biāo)記,尋找用作疫苗的抗原及毒力決定簇等。5cd-標(biāo)記技術(shù)藥物作用的靶標(biāo)多為蛋白質(zhì)。如何發(fā)現(xiàn)更多的藥物作用的靶蛋白是藥品開發(fā)面臨的主要挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)組研究能發(fā)現(xiàn)那些在健康人組織細(xì)胞中正常表達(dá)或不存在,而在患者組織細(xì)胞中異常表達(dá)或出現(xiàn)的蛋白質(zhì),為藥品開發(fā)提供新的藥物靶標(biāo),或新的生物標(biāo)記,還能發(fā)現(xiàn)與藥物毒性相關(guān)的蛋白質(zhì),用于預(yù)報藥物的毒副作用,從而減少到臨床試驗(yàn)階段才發(fā)現(xiàn)該藥物的副作用所造成的中間階段的損耗。除了藥物作用的靶蛋白的選擇外,觀察藥物對靶蛋白的作用及藥物毒性的研究也同樣重要。在這一研究領(lǐng)域中,可采用CD-標(biāo)記(CD-tagging)技術(shù)研究用藥期間蛋白質(zhì)組中的任一成員在分子和細(xì)胞水平的各種變化。其原理是將帶有CD-tagging的CD盒插入某一個表達(dá)基因的內(nèi)含子,結(jié)果該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA增加了一段外來序列,該基因編碼的蛋白質(zhì)增加了一個特殊的外來肽——抗原決定簇或熒光蛋白,這種外來肽作為標(biāo)記物,可用高效價的抗體識別或各種熒光檢測方法觀察,標(biāo)記的基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變化可用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、測序等方法觀察。因此,CD-標(biāo)記技術(shù)可用來研究基