lr4信號通路與炎癥因子互作機制研究

lr4信號通路與炎癥因子互作機制研究

樣本受體（ttls）是一個由病毒識別的受體，由11名成員（ttl111）組成，屬于i型膜蛋白。細胞外區(qū)域結(jié)構(gòu)上存在著充滿淺氨酸的重復(fù)序列，負責(zé)識別不同的致病性分子。細胞內(nèi)區(qū)域與il-1受體的細胞內(nèi)區(qū)域相似，這是受體激活后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TLRs分布廣泛,在外周血白細胞中表達水平最高,單核/巨噬細胞、B細胞、T細胞及樹突細胞(DC)均表達TLRsmRNA。TLRs最突出的生物學(xué)功能是促進細胞因子的合成與釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng);另一項功能是促進抗原提呈細胞的成熟,從而誘導(dǎo)機體的獲得性免疫反應(yīng),因而TLRs是機體介導(dǎo)天然免疫轉(zhuǎn)向獲得性免疫的橋梁。TLR4表達于許多的免疫和非免疫細胞,活化TLR4將誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)包括細胞因子、趨化因子等從而產(chǎn)生強有力的炎癥反應(yīng)。最初的研究發(fā)現(xiàn)TLR4是革蘭氏陰性細胞細胞壁成分脂多糖LPS的識別受體;LPS結(jié)合蛋白(LPS-bindingprotein,LBP)與LPS結(jié)合后,介導(dǎo)LPS與CD14相互作用,并由CD14將LPS轉(zhuǎn)運并錨定于由TLR4和髓樣分化蛋白-2(myeloiddifferentiationprotein,MD-2)構(gòu)成的受體復(fù)合物。CD14缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域,不能單獨轉(zhuǎn)導(dǎo)LPS信號,而MD-2是一種分泌型糖蛋白。研究表明LPS結(jié)合MD-2后,通過TLR4的細胞外富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)TLR4的聚合,從而誘導(dǎo)TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。近來的研究顯示紫杉醇,呼吸道合胞病毒的融合蛋白,鼠乳腺腫瘤病毒的包膜蛋白,熱休克蛋白60(hotshockprotein60,HSP60),HSP70,纖連蛋白透明質(zhì)酸寡聚糖,硫酸肝素多聚糖片段和纖維蛋白原以及HMGB1ju均能活化TLR4,表明TLR4在抗細菌、抗病毒的炎癥反應(yīng)中,以及在應(yīng)激狀態(tài)下均發(fā)揮重要作用。1tr34參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑1.1tirap/mal檢測tlr4信號分子在TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有許多轉(zhuǎn)接蛋白的參與。與配體結(jié)合后,TLR4二聚體化并發(fā)生構(gòu)象改變以活化其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,這些分子包括轉(zhuǎn)接分子髓樣分化因子88(MyD88),Toll/IL-1受體同源區(qū)(Toll/IL-1receptorhomologousregion,TIR)相關(guān)蛋白/MyD88轉(zhuǎn)接蛋白類似物(TIR-associatedprotein,TIRAP/MyD88adaptor-like,MAL)、IL-1受體相關(guān)激酶(IL-1R-associatedkinases,IRAKs)、轉(zhuǎn)化生長因子β活化的激酶(transforminggrowthfactor-βactivatedkinase,TAK1)、TAK1結(jié)合蛋白1(TAK1-bindingprotein1,TAB1)和TAB2以及腫瘤壞死因受體相關(guān)因子6(tumor-necrosisfactorreceptorassociatedfactor6,TRAF6)。MyD88由氨基端死亡結(jié)構(gòu)域(DD)、羧基端TIR(Toll/IL-1R)結(jié)構(gòu)域和一個短的連接序列組成。MyD88通過TIR結(jié)構(gòu)域與TLR4發(fā)生關(guān)聯(lián)、通過DD結(jié)構(gòu)域與IRAK發(fā)生關(guān)聯(lián)。同時MyD88被募集到TLR4后,通過TIR和DD結(jié)構(gòu)域形成同源二聚體。因此MyD88的功能是作為轉(zhuǎn)接蛋白連接TLR4和其下游含有DD結(jié)構(gòu)域的信號分子。TIRAP/MAL是在研究MyD88非依賴信號途徑過程中發(fā)現(xiàn)的,然而其參與MyD88依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。與MyD88缺陷小鼠相似,TIRAP/MAL缺陷小鼠對LPS的毒性作用表現(xiàn)出耐受性,而且不產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor,TNF-α),白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)或IL-12等。但是晚期NF-κB的活化仍然存在,IFN誘導(dǎo)的基因表達也不受影響,說明TIRAP/MAL確實參與了MyD88依賴性而不是非依賴性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖1)。IRAK家族有IRAK1,2,4和M4個成員。IRAKs氨基端含有1個DD結(jié)構(gòu)域,中心區(qū)含有1個絲氨酸/蘇氨酸激酶活性區(qū)。TLR4激活后,IRAK1表現(xiàn)出強烈的激酶活性,其激酶活性區(qū)對NF-κB活化非常重要。IRAK1是IRAK-4的底物,IRAK4缺陷小鼠喪失對LPS的反應(yīng)性;IRAK4異常的患者中,活化TLR4也不能誘導(dǎo)有效的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),表明IRAK4對于TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必不可少。TRAFs是一個進化保守的轉(zhuǎn)接蛋白家族。到目前為止,哺乳動物中發(fā)現(xiàn)6個成員,它們都有特征性的N末端卷曲螺管樣結(jié)構(gòu)域,被稱為TRAF-N;還有一個保守的C末端,被稱為TRAF-C。N末端含有指狀的RING結(jié)構(gòu),屬于鋅指結(jié)構(gòu),對下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是必需的,而C末端是連接上游分子的必需結(jié)構(gòu)。TRAF-6為TNF受體家族和TLR/IL-1R家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)服務(wù),它直接連接TNF受體家族,但通過與IRAKs結(jié)合后間接和TLR/IL-1R受體家族發(fā)生連接。在TNF受體家族和IRAKs中發(fā)現(xiàn)了一致性的TRAF-6結(jié)合區(qū)域,被命名為P-X-E-X-X-(D/E/F/W/Y)。TRAF-6活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1還需要TAK1、TAB1和TAB2。TAK1屬于MAPKKK(mitogen-activatedproteinkinasekinasekinase)家族。TAB1,TAB2是TAK1的兩個結(jié)合蛋白,TAB1的作用為活化TAK1,使其激酶活性增強,TAB2連接TAK1和TRAF6,并促使TAK1發(fā)揮其活性。然而,在TAB2缺陷鼠來源的胚胎成纖維細胞中,IL-1/LPS或TNF誘導(dǎo)的NF-κB活化并沒有被削弱,說明TAB2不是唯一的轉(zhuǎn)接蛋白。隨后發(fā)現(xiàn)的TAB3在結(jié)構(gòu)和功能上和TAB2相似,也與TAK1的活化有關(guān)。NF-κB家族有p65(REL-A),REL-B,胞質(zhì)REL,p50和p525個成員,它們以同源或異源二聚體的形式發(fā)揮作用。NF-κB通常與IκB(NF-κB抑制子)結(jié)合,以無活性形式存在。IκB激酶(IKK,由α,β,γ三個亞單位組成)與IκB結(jié)合以后,使其磷酸化、泛素化而降解,從而使NF-κB與IκB分離而進入核內(nèi),調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。而IKK復(fù)合體的激活需要TAK1。近來發(fā)現(xiàn)另一種激酶NF-κB誘導(dǎo)激酶(NF-κB-inducingkinase,NIK)能使IKK復(fù)合體活化,進而磷酸化NF-κB2的前體P100,使其易于被SCF(S-phasekinase-associatedprotein1-Cullin1-Fbox)家族的E3泛素化連接酶和β-TRCP(β-transducinrepeat-containingprotein)識別而降解為具有轉(zhuǎn)錄活性的P52。MyD88介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是LPS在LPB和CD14的幫助下與MD-2結(jié)合,誘導(dǎo)TLR-4/MD2異二聚化,使MyD88和MAL聚集到TLR4受體復(fù)合體。IRAK-1和IRAK4與該受體復(fù)合物結(jié)合后,引起IRAK-1的磷酸化,使其從受體復(fù)合體上解離,結(jié)合于TRAF-6并使其活化。TRAF-6通過兩條途徑進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo):(1)活化TAK1激活I(lǐng)KK復(fù)合體,誘導(dǎo)IκB磷酸化釋放NF-κB轉(zhuǎn)移至核內(nèi)啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄;或通過羧基末端與NIK作用,使NIK過表達而活化IKK復(fù)合體,誘導(dǎo)P100轉(zhuǎn)變成P52轉(zhuǎn)移至核內(nèi)啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。(2)通過進化保守信號媒介(evolutionarilyconservedsignalingintermediate,ESCIT)活化MEKK-1,激活C-Jun氨基端激酶(C-JunN-terminalkinase,JNK),P38,NF-κB。通過上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,TLR4介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的活化,誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄,介導(dǎo)早期的天然免疫反應(yīng)。1.2trif誘導(dǎo)的職高生藥物基因表達利用基因敲除技術(shù)的研究表明:MyD88缺陷小鼠并未完全喪失對LPS的反應(yīng)性。與野生型鼠比較,MyD88缺陷小鼠對LPS的反應(yīng)是以一種遲發(fā)的方式出現(xiàn)的,而且LPS誘導(dǎo)IRF-3的活化和IFN-β的表達均不受影響。這些結(jié)果顯示TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不只有MyD88依賴性途徑,還有MyD88非依賴途徑的存在?，F(xiàn)已證實轉(zhuǎn)接蛋白誘導(dǎo)IFN-β且含TIR的轉(zhuǎn)接蛋白(TIR-domain-containingadaptorproteininducingIFN-β,TRIF,又名TIR-domain-containingmolecule1,TICAM1)在TLR4的MyD88非依賴性途徑中發(fā)揮重要作用(圖1)。TRIF是一種含有TIR的轉(zhuǎn)接蛋白,其作用之一是活化IRF-3,誘導(dǎo)IFN-β基因的表達,進而影響干擾素誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。研究顯示連接TRIF和TLR4的是轉(zhuǎn)接蛋白TRIF相關(guān)接頭分子(TRIF-relatedadaptormolecule,TRAM,又名TICAM2)。TRAM在結(jié)構(gòu)上與MAL相似,也含有TIR結(jié)構(gòu)域,可不依賴MyD88而激活I(lǐng)RF-3,IRF-7和NF-κB。轉(zhuǎn)錄因子IRF-3被激活后入核與I型干擾素基因上游的干擾素敏感反應(yīng)元件(interferon-sensitiveresponseelement,ISRE)結(jié)合,從而使IFN基因活化表達。大量產(chǎn)生的IFN誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)基因表達,產(chǎn)生一系列炎癥相關(guān)因子(如趨化因子)。TLR4的MyD88非依賴途徑可引起NF-κB和IRF-3的遲發(fā)激活。在此過程中,首先TLR4通過TRAM作用于TRIF,TRIF通過N末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域與TRAF6結(jié)合,隨后活化IKK復(fù)合體,使IκB泛素化并降解,最終導(dǎo)致NF-κB釋放入核。而IRF3的活化則需要更多的激酶復(fù)合體參與,如TRIF-TBK1(TRAF結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白-1)-IKK復(fù)合體,作為IRF3激酶使其磷酸化。IRF3活化后與ISRE結(jié)合,誘導(dǎo)包括IFN-β在內(nèi)的一系列基因的轉(zhuǎn)錄,最終引起炎癥反應(yīng)。1.3pi3k-akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機制及其作用傳統(tǒng)觀點認(rèn)為LPS對于組織和細胞而言是一種損傷因子。研究表明LPS所介導(dǎo)的心肌缺血/再灌注損傷與LPS活化TLR4誘導(dǎo)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),TLR4缺陷小鼠對于缺血/再灌注引起的心肌損傷具有更好的抵抗性,抑制TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也有利于控制損傷的程度。然而,在克隆TLR4之前,許多研究發(fā)現(xiàn)LPS預(yù)處理能有效誘導(dǎo)對缺血/再灌注損傷的保護作用。最近的研究顯示LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的損傷保護與LPS活化PI3K-AKT(proteinkinaseB)途徑有關(guān),LPS預(yù)處理顯著增加了心肌組織中磷酸化AKT水平,化學(xué)抑制劑抑制PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后,LPS預(yù)處理的損傷保護作用消失,表明PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的損傷保護中發(fā)揮重要作用(圖1)。PI3K的功能是將磷酸化脂質(zhì)底物磷脂酰肌醇2磷酸(phosphatidylinositol4,5biphosphate,PIP2)轉(zhuǎn)變成磷脂酰肌醇3磷酸(phosphatidylinositol3,4,5biphosphate,PIP3)。PIP3是一個重要的細胞內(nèi)第2信使分子,AKT是其主要的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一。活化PI3K-AKT信號通路與細胞生存、生長、增殖、血管生成、代謝和細胞遷移有關(guān)。PI3K-AKT信號通路具有抗炎作用,抑制AKT的活化促進TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。然而PI3K-AKT本身參與了TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在小鼠的巨噬細胞中,LPS刺激誘導(dǎo)PI3K與MyD88形成復(fù)合物,并介導(dǎo)IL-1β,TNF-α和巨噬細胞炎癥蛋白2(macrophageinflammatoryprotein2,MIP-2)的釋放,其中IL-1β和TNF-α的分泌與AKT活化NF-κB有關(guān);AKT的顯性負性突變體引起MyD88依賴性的NF-κB活化異常,MyD88的顯性負性突變體阻斷LPS誘導(dǎo)AKT的磷酸化;這些結(jié)果說明在TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中,存在TLR4→MyD88→PI3K→AKT→NF-κB信號通路。在LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的損傷保護過程中,TLR4-AKT通路發(fā)揮作用;而缺血/再灌注中LPS造成的組織損傷則依賴于TLR4-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。2阻斷l(xiāng)ps,tlr4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)近年來,已發(fā)現(xiàn)許多可以抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白。ST2和單個免疫球蛋白IL-1受體相關(guān)分子(singleimmunoglobulinIL-1R-relatedmolecule,SIGIRR)是擁有TIR結(jié)構(gòu)域的細胞表面受體,通過阻斷LPS與TLR4結(jié)合抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號蛋白。MyD88s(MyD88short)是MyD88的剪接變異體,缺乏與I