酵母雙雜交系統(tǒng)的分子間相互作用及調(diào)控機(jī)制

酵母雙雜交系統(tǒng)的分子間相互作用及調(diào)控機(jī)制

許多生物過程由蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)以及dna和蛋白質(zhì)之間的相互作用實(shí)現(xiàn)。對(duì)這些大分子之間相互作用的生物化學(xué)和遺傳分析有助于澄清生物過程中的分子機(jī)制。酵母單雜交,雙雜交及三雜交系統(tǒng)技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展極大地推動(dòng)了這方面研究的進(jìn)展,成為分析鑒定蛋白-蛋白,DNA-蛋白相互作用及調(diào)控的強(qiáng)有力工具,并顯示出廣闊的應(yīng)用前景。1酵母雙雜交系統(tǒng)的構(gòu)建酵母單雜交系統(tǒng)主要用來分離鑒定與特異DNA序列結(jié)合作用的蛋白質(zhì)并同時(shí)獲得其編碼基因。酵母單、雙雜交系統(tǒng)均利用了許多真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子(transcriptionactivator),如GAL4的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特點(diǎn),即自身含有功能上必須的兩個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域-DNA結(jié)合域與轉(zhuǎn)錄激活域。在酵母單雜交系統(tǒng)中,與轉(zhuǎn)錄激活域融合的結(jié)合蛋白與靶DNA序列的相互作用可以同樣激活報(bào)道基因的表達(dá),而酵母雙雜交系統(tǒng)中則利用此特點(diǎn)可以構(gòu)建兩種雜合蛋白,一種為已知蛋白X與DNA結(jié)合域融合的雜合蛋白,一種為未知蛋白Y與轉(zhuǎn)錄激活域間的融合蛋白。當(dāng)編碼此兩種相應(yīng)雜合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入酵母后,如果蛋白X和Y之間存在相互作用,則表達(dá)產(chǎn)生的兩種雜合蛋白會(huì)由于這種相互作用使其中的轉(zhuǎn)錄激活域進(jìn)入其正常作用的啟動(dòng)子(UASG)位點(diǎn)而激活報(bào)道基因的表達(dá)(如lacZ)。其作用模式簡(jiǎn)圖見圖1。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立已使人們成功地測(cè)定了許多在生物學(xué)過程中可能起重要作用的蛋白與蛋白間的相互作用,例如原癌基因編碼的蛋白與各種靶蛋白間的相互作用。同時(shí),雙雜交系統(tǒng)還可以被用來確定參與蛋白-蛋白相互作用中的特異性結(jié)構(gòu)域。此外,雙雜交系統(tǒng)還被用來設(shè)計(jì)尋找能與細(xì)菌或病毒致病性蛋白相互作用而具有一定醫(yī)療價(jià)值的蛋白多肽。應(yīng)用雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在從轉(zhuǎn)錄激活域融合蛋白庫中找出與已知蛋白相互作用的靶蛋白后,并可以同時(shí)獲得該作用蛋白的編碼基因,而不需通過制備純化蛋白或抗體等繁瑣生化手段來建立這種相互作用關(guān)系。近年來,基于各種具體情況人們對(duì)酵母雙雜交系統(tǒng)作了各種修飾改進(jìn),如以lexADNA結(jié)合域代替GAL4結(jié)合域;以活性較弱的轉(zhuǎn)錄激活域代替GAL4激活域從而避免假陽性及強(qiáng)激活域?qū)?xì)胞帶來的毒害作用。2ura3基因產(chǎn)物的擴(kuò)增蛋白-蛋白間的相互作用一旦被確定,一般還要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)來研究這種相互作用的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制。對(duì)相互作用雙方中發(fā)生的能消除此種相互作用的突變分析不僅能確定參與作用的結(jié)構(gòu)成分,而且獲得的突變體也是進(jìn)行體內(nèi)功能分析的有用遺傳工具。酵母反向雜交系統(tǒng)的出現(xiàn)使得兩步甚至一步檢測(cè)分離能解除已知相互作用的突變或反式作用因子成為可能。反向雜交系統(tǒng)的關(guān)鍵在于系統(tǒng)中引進(jìn)的報(bào)道基因?yàn)榻湍窾RA3基因,它被置于含有一定數(shù)目GAL4結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子的嚴(yán)緊控制下。URA3基因產(chǎn)物既為尿嘧啶生物合成所必須同時(shí)又能催化5-FOAO轉(zhuǎn)化生成一細(xì)胞毒性化合物。因此,當(dāng)兩種蛋白發(fā)生正常的相互作用時(shí),由于激活了URA3基因的表達(dá)而使細(xì)胞不能在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng);而當(dāng)作用雙方發(fā)生突變消除或減弱了這種相互作用后,就可以在5-FOA平坂上得到抗性生長(zhǎng)菌落。通過實(shí)驗(yàn)可以確定檢測(cè)引起URA3表達(dá)極小變化的較弱突變所需的最少GAL4結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目及最低5-FOA濃度,從而最大限度地提高檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度。Vidal等在此基礎(chǔ)上結(jié)合進(jìn)一步的正向選擇,確定了轉(zhuǎn)錄因子E2F-1中另一個(gè)新的參與與DP1結(jié)合的區(qū)域。如果在上述含有依賴于GAL4結(jié)合位點(diǎn)的URA3負(fù)選擇報(bào)道基因的菌株中再引入一個(gè)依賴于LexA結(jié)合位點(diǎn)的His4或LacZ正選擇報(bào)道基因,就可以一步篩選出目的蛋白中發(fā)生的能解除與一個(gè)靶蛋白相互作用而仍保持與另一個(gè)靶蛋白相互作用的突變或反式調(diào)節(jié)因子。這一系統(tǒng)尤其可以用于分析復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)途徑中具有多個(gè)作用靶點(diǎn)的蛋白,從而為闡明細(xì)胞中各種復(fù)雜生物學(xué)過程之間的相互關(guān)系提供重要信息?？傊?由于酵母反向雜交系統(tǒng)的獨(dú)特性能使得人們能從極度復(fù)雜的cDNA庫或肽庫中篩選能解離特異性蛋白相互作用的反式調(diào)節(jié)因子(可能通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、對(duì)底物蛋白的修飾等發(fā)揮作用),而且通過篩選能特異性解除與疾病相關(guān)的異常蛋白相互作用的效應(yīng)肽分子,系統(tǒng)本身還可以用于開發(fā)有藥用價(jià)值的生物制品。3基于生物活性的三雜交分析生物學(xué)中常常利用小的有機(jī)配體來研究闡明許多生物學(xué)過程,如信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞分化調(diào)控等的發(fā)生機(jī)制,配體-受體間的相互作用也是醫(yī)藥工業(yè)中藥物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。一旦某一受體被證明與某一疾病相關(guān),尋找能與此受體結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能的配體小分子就顯得極為重要,因?yàn)檫@些配體分子可以作為被開發(fā)藥物的首選目標(biāo)。在酵母雙雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,Licitra等結(jié)合合成有機(jī)化學(xué)生產(chǎn)的異源雜交配體,建立了一種體內(nèi)分析配體受體相互作用的三雜交系統(tǒng)。這種系統(tǒng)不僅可以用來迅速分離鑒定與已知配體分子相互作用的受體編碼cDNA基因,而且還能篩選已知受體的未知配體分子。其作用模式見圖2。利用此種方法,Licitra等從JurkatcDNA庫中篩選到了免疫抑制劑FK506的受體編碼cDNA片段。此外,與酵母雙雜交系統(tǒng)或噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)所要求的多肽配體庫相比,三雜交系統(tǒng)所能篩選的配體類型范圍要廣泛得多,它可以包括由D-氨基酸組成的多肽配體到任何合成的有機(jī)化合物配體。同時(shí),與常規(guī)的體外生化篩選方法相比,經(jīng)過酵母三雜交系統(tǒng)篩選得到的配體分子,它們的細(xì)胞通透性及胞內(nèi)穩(wěn)定性也同時(shí)得到了確認(rèn),從而大大提高了篩選效率。當(dāng)然,對(duì)影響其相互作用的許多因素如產(chǎn)生陽性信號(hào)所需的配體受體最低親和力、細(xì)胞對(duì)配體分子的通透性等還有待進(jìn)一步研究。D.J.SenGupea等人根據(jù)同樣的原理建立了一種在酵母中檢測(cè)RNA-蛋白特異性相互作用的三雜交系統(tǒng)。與Licitra等的三雜交系統(tǒng)使用雜合配體分子不同的是,D.J.SenGupea等的三雜交系統(tǒng)使用了一種雜合的RNA分子來聯(lián)接重建轉(zhuǎn)錄激活功能。此系統(tǒng)的建立對(duì)研究RNA加工、翻譯、mRNA穩(wěn)定性、RNA病毒的包裝及感染性等許多生物學(xué)過程中RNA-蛋白間功能性相互作用是極為有利的。4蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)圖和相互作用的生物功能相關(guān)性隨著生物化學(xué)及遺傳學(xué)技