酵母雙雜交系統(tǒng)的研究進展

酵母雙雜交系統(tǒng)的研究進展

在生命體內(nèi)，蛋白質必須通過與其他分子的相互作用來完成生命，這些生物分子的相互作用是生命的基礎。研究蛋白質之間的相互作用是了解蛋白質生物學功能的重要手段之一。而利用傳統(tǒng)的生物化學方法難以洞察在生物體內(nèi)瞬間發(fā)生的蛋白質之間的相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)由Fieldsetal.(1989)發(fā)明,利用釀酒酵母GAL4蛋白的特性建立了研究蛋白質間相互作用的全新方法。酵母雙雜交系統(tǒng)自建立以來,已經(jīng)逐步發(fā)展成一個較完善的分析蛋白質與蛋白質相互作用的系統(tǒng),現(xiàn)又衍生出酵母單雜交系統(tǒng)(yeastone-hybridsystem)、反向雙雜交系統(tǒng)(reversetwo-hybridsystem)、雙誘餌系統(tǒng)(dual-baitsystem)和三雜交系統(tǒng)(three-proteinsystem)等。酵母雙雜交系統(tǒng)自創(chuàng)建以來,已逐步成為研究蛋白質相互作用最重要的手段,揭示了生物體內(nèi)大量未知蛋白間的相互作用。在植物與病原物識別及抗病信號傳導研究中也發(fā)揮了重要作用。1結構上的共性Flor(1971)提出的基因對基因學說的分子基礎就是配體(ligand)與受體(receptor)的結合,抗病基因的產(chǎn)物作為受體對病原物直接或間接產(chǎn)生的配體或激發(fā)子進行識別,進而激活下游的防御反應。目前已克隆了50多例符合基因對基因概念的植物抗病基因,盡管它們所抵抗的病原物的種類千差萬別,但在結構上具有一定的共性,如含有亮氨酸重復序列(leucine-richrepeat,LRR)也支持了配體-受體模式的假說?，F(xiàn)已克隆的來自病毒、細菌及真菌的無毒基因(Avr)的序列分析表明,它們彼此之間相似性很小,大部分Avr基因可以編碼專一性的激發(fā)子蛋白(elicitorprotein),Avr基因的多樣性決定了基因對基因抗性進化理論中寄主植物的對病原物的專一性識別。目前與抗病基因相應的無毒基因的克隆,也為研究配體與受體模式提供了可能(Yangetal.,1997;deWitetal.,1999;Ellisetal.,2000andWhiteetal.,2000)。盡管如此,在酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)明之前,植物抗病蛋白與病原物無毒蛋白之間是否真正發(fā)生結合,一直缺乏實驗證據(jù)的支持。1996年利用酵母雙雜交系統(tǒng)在植物抗病蛋白與病原物無毒蛋白相互作用研究領域已取得了重大突破,目前利用酵母雙雜交技術已驗證了5對抗病蛋白與無毒蛋白之間的直接互作和3對蛋白之間的間接互作。1.1受刺激物和無毒物質之間的直接比較1.1.1pto蛋白的鑒定番茄抗葉斑病的Pto基因是國際上克隆的第一個符合Flor基因對基因學說意義上的植物抗病基因(Martinetal.,1993)。1996年美國科學家利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗證了番茄抗葉斑病的Pto蛋白與其相對應的葉斑病菌Pseudomonassyringaepv.tomato中AvrPto無毒蛋白之間可以發(fā)生特異性的結合,同時證實Pto蛋白在204位上的蘇氨酸對于與AvrPto蛋白的專一性識別是必不可少的(Tangetal.,1996;Scofieldetal.,1996)。Pto與AvrPto蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的直接互作結合,首次為Flor基因對基因學說提供了分子水平上的實驗證據(jù),對于寄主與病原物相互識別作用機制的研究具有劃時代的意義。1.1.2pi-ta與avr-pita蛋白的相互作用與水稻抗稻瘟病基因Pi-ta存在基因對基因關系的無毒基因是Avr-Pita,Jiaetal.(2000)證實Avr-Pita蛋白在酵母雙雜交及體外結合實驗中均可與Pi-ta蛋白的亮氨酸重復序列結構域(LRD)結合,Pi-ta蛋白LRD結構域或Avr-Pita中單個氨基酸的缺失均可導致蛋白結合的破壞及植物抗病性的喪失。表明Pi-ta與Avr-Pita的直接結合觸發(fā)了Pi-ta介導的抗病性。1.1.3利用基因組織特點檢測細胞中rars1-r-pcr的表達RRS1是從擬南芥中克隆的第一例具有TIR-NBS-LRR結構的隱性抗病基因,但它在轉基因植物中表現(xiàn)為顯性,將其定義為抗病基因還主要基于以下一些特點:(1)序列與其它抗病基因相似,編碼的蛋白屬于TIR-NBS-LRR結構;(2)它是SA途徑和NDR1信號傳導元件所必需的;(3)在攜帶有RRS1-S的感病品種中導入RRS1-R后,再接種青枯病菌不能發(fā)病。Deslandesetal.(2003)研究發(fā)現(xiàn),RRS1抗病蛋白與青枯病菌分泌的typeⅢ效應子PopP2蛋白在雙雜交實驗中可以發(fā)生互作結合,PopP2與抗病蛋白RRS1共定位在細胞核中,并且RRS1在核中的位置取決于PopP2的存在。隨后Lahayeetal.(2004)對RRS1與PopP2的識別過程進行了推測,構建了簡單的模型。1.1.4煙草n基因的識別煙草N基因與煙草花葉病毒(TMV)之間的關系也符合基因對基因學說,Uedaetal.(2006)利用酵母雙雜交及體外結合pull-down方法,驗證了N蛋白與TMV的P50結構域可以直接結合,并且這種相互作用必須有ATP的參與。煙草N基因對TMV的識別過程涉及幾個步驟,首先ATP與N蛋白形成復合物,N蛋白與p50結合后增強了ATP的水解,形成的ADP/N復合物的空間構像發(fā)生變化,便于與下游的信號傳導元件相互作用。這一模式構成了理想的蛋白核心“proteinmachine”。1.1.5蛋白序列的可變性分析亞麻抗銹病基因L5、L6和L7與相對應的銹菌無毒基因AvrL567之間存在基因對基因互作關系,Doddsetal.(2006)利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗證了L5、L6和L7抗病蛋白與AvrL567無毒蛋白之間的直接互作,并且它們之間的直接識別作用涉及了抗病基因及無毒基因位點高度的遺傳多樣性,AvrL567位點基因序列的可變性,決定了與不同抗病基因間識別的專一性。L5、L6和L7與AvrL567之間的關系再次驗證了抗病基因與無毒基因協(xié)同進化的觀點。1.2抗病性蛋白質與無毒蛋白之間的間接關系在多數(shù)植物-病原物互作系統(tǒng)中尚未找到抗病蛋白與無毒蛋白直接結合的證據(jù),但已發(fā)現(xiàn)有些抗病蛋白與無毒蛋白復合體的形成需要其它蛋白的參與。1.2.2avr9-habs-cf9的互作關系具有胞外結構的番茄抗葉霉病(Cladosporiumfulvum)Cf-9是較早克隆的植物抗病基因,與之相對應Avr9無毒基因也被克隆,但利用多種方法也未鑒定出它們之間的互作關系。Ludereretal.(2001)報道,利用標記的Avr9在番茄中捕捉到了一個高度親和結合位點HABS蛋白可以與之結合。Avr9-HABS-Cf9三方互作將激活防御反應。HABS蛋白在煙草等茄屬植物中也有文獻佐證。1.2.3tip蛋白和cp體外蛋白Renetal.(2000)利用酵母雙雜交系統(tǒng),從擬南芥中捕獲到與芫菁皺縮病毒TCV病毒外殼蛋白CP結合的TIP蛋白,TIP蛋白屬于NAC蛋白家族,參與植物胚的形成及開花過程的調(diào)控。CP外殼蛋白與TIP蛋白結合結構域的氨基酸位點突變實驗證明,TIP-CP相互作用的喪失直接影響了寄主植物對TCV病毒的抗性。說明抗病基因HRT所介導的對TCV病毒的抗性,需要TIP蛋白與病毒外殼蛋白的結合,這種結合導致了擬南芥防御相關基因的表達。2防御反應生物學中具有結構和功能的動物基植物在與病原物進行識別后,觸發(fā)不同的早期信號傳導,誘導產(chǎn)生的防御反應包括信號傳導網(wǎng)絡以及快速激活基因的表達,研究發(fā)現(xiàn),植物與動物中的防御信號傳導過程中某些因子在結構和功能上具有相似性。2.1番茄抗病性信號的傳播方法2.1.1pto基因突變體誘導抗體建構的應途徑自1993年第一例來自番茄的植物抗病基因Pto問世以來,陸續(xù)從不同作物中克隆的50多例抗病基因,其中來自水稻、大麥和擬南芥的Xa21、Rpg1和PBS1基因是為數(shù)不多的幾例編碼蛋白激酶結構的抗病蛋白。激酶通過磷酸化和脫磷酸化的過程在生物信號傳導中扮演著重要角色,對上述具有激酶結構域抗病蛋白信號傳導途徑的研究,對于解析由抗病蛋白所觸發(fā)的一系列防御反應途徑具有重要意義。利用酵母雙雜交系統(tǒng)在以Pto抗病蛋白為核心的信號傳導鏈中先后鑒定出多種重要的蛋白元件,已初步勾勒出了Pto抗病信號傳導途徑的線條。Zhouetal.(1995)利用酵母雙雜交系統(tǒng)從番茄基因文庫中“釣”出了與Pto蛋白互作的蛋白Pti1。Pti1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,已經(jīng)被證實是Pto蛋白激酶專一性磷酸化作用的底物。Salmeronetal.(1996)利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究證實了Pto蛋白功能的發(fā)揮與另一個抗病蛋白Prf(具有NBS-LRR結構)密不可分,認為Prf蛋白可能是Pto激酶磷酸化的直接作用底物。Zhouetal.(1997)利用Pto為誘餌,利用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定了3個轉錄因子蛋白Pti4/5/6,它們病程相關蛋白(PR)啟動子區(qū)域的DNA結合結構域,作為Pto蛋白激酶的磷酸化底物,Pti4受乙烯和茉莉酸的誘導,推測Pto蛋白激酶通過與PRbox結合的轉錄因子的互作調(diào)控番茄防御基因的表達(Jiaetal.,1999;Guetal.,2000)。不同蛋白在番茄抗病信號傳導中扮演了不同的角色,并通過一系列的串連激活反應最終使番茄產(chǎn)生抗病性,抗病反應的多途徑、多分支由此可見一斑。2.1.2cf-9基因的c-末端誘導的誘導效果番茄抗葉霉病(Cladosporiumfulvum)的Cf家族抗病基因Cf-2、Cf-4、Cf-5和Cf-9所編碼的蛋白質結構相對簡單,不含核苷酸結合位點(NBS),僅有胞外LRR結構域和跨膜結構域TM,但同樣具有對病原菌專一性識別及信號傳導的功能(Jonesetal.,1994;Thomasetal.,1997;Dixonetal.,1998)。番茄中的Cf抗病基因家族為一系列同源基因,它們分別對攜帶不同無毒基因的小種產(chǎn)生抗性。位于胞外的LRR結構可能對病菌專一性識別發(fā)揮了作用。Cf抗性基因位點由一系列同源基因組成,序列分析比較發(fā)現(xiàn),Cf蛋白的羧基端的序列十分保守,不可能擔負對復雜多變的不同病原菌小種的識別任務,所以推測對病原菌的專一性識別可能是由位于細胞外的氨基末端上多變的LRR結構所承擔(Ellisetal.,1998;Kruijtetal.,2005;Rivasetal.,2005)。Rivasetal.(2005)利用Cf-9基因位于胞質內(nèi)的C-端為誘餌,在酵母雙雜交系統(tǒng)中捕獲到了與Cf-9互作的硫氧還蛋白CITRX(Cf-9-interactingthioredoxin)。病毒誘導的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)實驗顯示,Cf-9與CITRX之間的結合加速了番茄及煙草中由Cf-9/Avr9觸發(fā)的過敏性壞死反應,觸發(fā)了活性氧的積累、蛋白激酶活性的改變及防御相關基因的誘導,增強了不含Cf基因感病寄主對葉霉病菌(Cladosporiumfulvum)的抗性。通過Cf-9的誘導,CITRX扮演了一個細胞凋亡和防御反應的負調(diào)控因子,這種反應不受Cf-2的誘導。Cf-9基因的C-末端被CITRX所識別是啟動負調(diào)控作用的前提,這也是第一篇有關硫氧還蛋白參與植物抗病性調(diào)控的報道。Rowlandetal.(2005)利用VIGS技術,在番茄Cf介導的抗性反應中鑒定出了Avr9/Cf-9誘導的蛋白激酶1(Avr9/Cf-9inducedkinase1,ACIK1),ACIK1絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是Cf-9/Avr9及Cf-4/Avr4介導的HR反應所必需的蛋白,但在其它的抗性系統(tǒng),如Pto/AvrPto,Rx/PXV及N/TMV系統(tǒng)中并不需要該蛋白的參與。Nekrasovetal.(2005)根據(jù)酵母雙雜交實驗結果,推測CITRX可能作為一個連接體,在Avr9激活Cf-9胞質結構域時起一個補充作用,在這種相互作用中并不需要CITRX和ACIK1蛋白的催化作用。2.2公體上的基因表達擬南芥的EDS1和PAD4基因編碼脂肪酶類蛋白,Feysetal.(2001)年研究發(fā)現(xiàn),它們在抗病基因介導的抗病性反應中起重要作用。EDS1與植物的HR反應有關,水楊酸途徑與EDS1和PAD4密不可分。酵母雙雜交分析揭示出EDS1能夠與PAD4相互作用形成二聚體。免疫共沉淀實驗中EDS1和PAD4蛋白在健康的及病原菌誘導的植物細胞中均可發(fā)生相互作用。擬南芥的NPR1基因是系統(tǒng)獲得性抗病性(systemicacquiredresistance,SAR)及水楊酸(salicylicacid,SA)途徑關鍵的調(diào)控因子,為了研究NPR1的功能,Chernetal.(2005)將擬南芥的NPR1基因在水稻中過量表達,轉基因水稻對白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的抗性增強,且NPR1在mRNA水平上的積累與抗病性直接相關。在酵母雙雜交系統(tǒng)中篩選獲得了與NPR1互作的4個屬于bZIP家族的蛋白編碼基因rTGA2.1,rTGA2.2,rT-GA2.3和rLG2,它們與擬南芥中的TGA2基因的相似率在75%~81%。NPR1與rTGA2.1之間的互作在體外的pull-down實驗中得到了進一步證實。這是首例擬南芥NPR1基因可以增強單子葉植物抗病性的報道,說明單子葉和雙子葉植物中NPR1介導的抗病信號傳導途徑具有一定的保守性。擬南芥的基因組含有6個NPR1相關的基因,NPR4與NPR1的同源性只有36%,但是在雙雜交系統(tǒng)中,它們能夠與一系列相同的TGA轉錄因子互作。突變試驗證實,NPR4是植物抵抗病原物基礎防御反應所必不可少的蛋白,在SA與茉莉酸(JA)途徑信號傳導鏈中存在一定的交叉(Liuetal.,2005)。Kimetal.(2002)年研究發(fā)現(xiàn),與NPR1互作的TGA5在轉基因植物中高水平的表達,使得擬南芥對由卵菌綱真菌引起的霜霉病(Peronosporaparasitica)的抗性大大增強。RAR1是與多種植物抗病基因介導的信號傳導途徑中處在早期的信號中心,Azevedoetal.(2002)報道RAR1能夠與調(diào)節(jié)細胞循環(huán)的SGT1蛋白發(fā)生互作,RAR1-SGT1復合物也能夠與2個COP9信號元件互作,構成了植物抗病反應的信號傳導鏈。Takahashietal.(2003)年利用酵母雙雜交技術又鑒定出一個與RAR1互作的熱激蛋白90(heashockprotein90,HSP90),RAR1與HSP90含有AT-Pase的N基端結合,HSP90也能夠專一性地與SGT1結合,在擬南芥中HSP90抑制子可以降低HR反應并破壞由RPS2抗病基因介導的對葉斑病的抗性,認為RAR1與SGT1在抗病反應中功能的發(fā)揮與HSP90蛋白密切相關。擬南芥的MAP蛋白激酶4(MPK4)是植物防御反應的調(diào)控因子,也是調(diào)控SA和JA途徑防御基因表達所必需的蛋白。Andreassonetal.(2005)對MPK4信號傳導研究發(fā)現(xiàn),MKS1是MPK4蛋白的作用底物,在基因組范圍內(nèi)對轉基因植物的轉錄框架進行了全面的分析,發(fā)現(xiàn)SA抗病途徑完全依賴于MKS1蛋白,MKS1在野生型植物中的過量表達可激活SA介導的抗病反應。利用雙雜交技術又進一步捕獲到了與MKS1互作的WRKY轉錄因子WRKY25和WRKY33。MKS1在MPK4調(diào)控WRKY轉錄因子激活的防御反應中扮演著十分重要的角色。目前國際上對植物抗病信號傳導的研究主要集中在模式植物番茄和擬南芥中,在其它作物中得研究還十分有限。目前利用酵母雙雜交技術在馬鈴薯和水稻抗病信號傳導研究中取得了初步進展。2.3種ap1蛋白互通Fengetal.(2003)從馬鈴薯抗病資源材料MS-42.3中分離獲得了具有體外抑菌活性的抗菌蛋白AP1。采用酵母雙雜交系統(tǒng),以AP1蛋白為誘餌,從MS-42.3cDNA文庫中篩選獲得了幾種與AP1發(fā)生互作的,其中4種重要的蛋白有(1)蛋白激酶通過磷酸化將信號傳遞給下游的元件;(2)ATP合成酶b-亞基,為代謝及信號傳導提供能量;(3)乙烯受體蛋白,是乙烯介導的抗病途徑中重要的受體蛋白;(4)定位在葉綠體中的鐵硫蛋白,早期的膠體金標記定位研究發(fā)現(xiàn),AP1蛋白在葉綠體中有較多沉積。說明AP1蛋白功能的發(fā)揮可能涉及與葉綠體中蛋白的互作(馮潔等,2004)。推斷AP1蛋白的表達和抗病信號傳導與葉綠體蛋白有密切關系,涉及乙烯信號傳導途徑及與能量代謝有關的蛋白。2.4osk3蛋白激酶在水稻誘導的亞基水稻中目前已克隆了5種SNF-1類蛋白激酶,命名為OSK1-5,它們主要與水稻對環(huán)境及營養(yǎng)壓力等逆境的反應有關。Kimetal.(2000)年報道,稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)接種水稻后可造成OSK3的強烈表達,說明OSK3蛋白激酶可能參與了植物的抗病性。OSK3蛋白激酶由3個亞基組成,蛋白激酶做為α亞基,β和γ亞基對α亞基起調(diào)控作用。以水稻OSK3蛋白激酶為誘餌,利用酵母雙雜交系統(tǒng)(1)從水稻cDNA文庫中篩選獲得了3個與OSK3蛋白激酶互作的β亞基,并克隆了全長基因;(2)發(fā)現(xiàn)OSK3蛋白激酶可與2個Ras轉錄調(diào)控蛋白和Myc類轉錄蛋白之間結合;(3)證明OSK3蛋白激酶與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶互作;(4)捕獲了位于OSK3蛋白激酶下游的產(chǎn)生活性氧(ROS)的草酸氧化酶(Fengetal.,2003)。草酸氧化酶可氧化草酸產(chǎn)生H2O2,通過多種方式在植物抗病反應中起到對病原菌產(chǎn)生直接的殺傷作用、使細胞壁糖蛋白形成氧化交聯(lián)降低細胞壁對病菌產(chǎn)生的降解酶的敏感度及誘導SAR的產(chǎn)生及協(xié)調(diào)過敏性壞死反應等(Levineetal.,1994;Wuetal.,1995)。因此,草酸氧化酶作為水稻OSK3蛋白激酶的信號傳導下游,直接參與水稻的抗病反應。3酵母雙雜交無法確定蛋白質互作的最容易取得性酵母雙雜交系統(tǒng)以其靈敏性、簡便性及廣泛性等特點而被應用到諸多方面的研究,但該系統(tǒng)具有其自身的局限性。首先是不能檢測所有蛋白間的互作,如(1)不能檢測需要3個或3個以上蛋白結合的相互作用;(2)不適合檢測涉及膜蛋白的相互作用;(3)有些誘餌蛋白表達后,會對酵母細胞產(chǎn)生毒性,不適合做誘餌基因。盡管存在上述缺陷,但酵母雙雜交系統(tǒng)仍是目前所建立的鑒定蛋白質互作最標準的技術。目前在酵母雙雜交系統(tǒng)基礎上衍生出的其它雜交系統(tǒng)也都有其特定的適用范圍。其次是假陽性的存在,即通過雙雜交觀察到的蛋白質的相互作用在真實情況下不一定發(fā)生,但目前新系統(tǒng)中由于將多個報告基因組合在一起,可以基本消除假陽性。再次是假陰性的問題,即在生物體內(nèi)可發(fā)生蛋白間的相互作用,但由于種種原因在雙雜交系統(tǒng)中觀察不到,如(1)有些蛋白之間的互作對載體構建時細小的變化十分敏感,對所采用的雙雜交系統(tǒng)有偏好;(2)蛋白在酵母中表達過量時,造成空間的積壓,影響了蛋白間的專一性互作;最后,蛋白質間的相互作用還必須結合其它手段加以驗證,如體外Pull-down及免疫共沉淀技術(co-immunoprecipitation)等。4價格補充4.1dna地面-基因表達框架基因組學(genomic)蛋白質組學(proteomic)合在一起,統(tǒng)稱為omic,它們的結合有助于在全基因組水平上分析細胞信號、基因表達框架及蛋白質-蛋白質相互作用,盡管DNAmicroarray技術已被證實在分析蛋白質的功能、信號傳導途徑方面具有顯而易見的優(yōu)勢,但基因的功能需要通過它們的蛋白產(chǎn)物的活性來加以證實。因此,蛋白的分析也同樣被期待可產(chǎn)生許多的信息,將它們組合在一起,構成一個完整的拼圖板。雙向電泳、質譜及蛋白質微點陣(microarrays)方法相繼涌現(xiàn),使得大規(guī)模分析蛋白質信號傳導途徑成為可能。4.2酵母蛋白互作網(wǎng)絡