酵母雙雜交系統(tǒng)的研究進(jìn)展

酵母雙雜交系統(tǒng)的研究進(jìn)展

在生命體內(nèi)，蛋白質(zhì)必須通過(guò)與其他分子的相互作用來(lái)完成生命，這些生物分子的相互作用是生命的基礎(chǔ)。研究蛋白質(zhì)之間的相互作用是了解蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的重要手段之一。而利用傳統(tǒng)的生物化學(xué)方法難以洞察在生物體內(nèi)瞬間發(fā)生的蛋白質(zhì)之間的相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)由Fieldsetal.(1989)發(fā)明,利用釀酒酵母GAL4蛋白的特性建立了研究蛋白質(zhì)間相互作用的全新方法。酵母雙雜交系統(tǒng)自建立以來(lái),已經(jīng)逐步發(fā)展成一個(gè)較完善的分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng),現(xiàn)又衍生出酵母單雜交系統(tǒng)(yeastone-hybridsystem)、反向雙雜交系統(tǒng)(reversetwo-hybridsystem)、雙誘餌系統(tǒng)(dual-baitsystem)和三雜交系統(tǒng)(three-proteinsystem)等。酵母雙雜交系統(tǒng)自創(chuàng)建以來(lái),已逐步成為研究蛋白質(zhì)相互作用最重要的手段,揭示了生物體內(nèi)大量未知蛋白間的相互作用。在植物與病原物識(shí)別及抗病信號(hào)傳導(dǎo)研究中也發(fā)揮了重要作用。1結(jié)構(gòu)上的共性Flor(1971)提出的基因?qū)驅(qū)W說(shuō)的分子基礎(chǔ)就是配體(ligand)與受體(receptor)的結(jié)合,抗病基因的產(chǎn)物作為受體對(duì)病原物直接或間接產(chǎn)生的配體或激發(fā)子進(jìn)行識(shí)別,進(jìn)而激活下游的防御反應(yīng)。目前已克隆了50多例符合基因?qū)蚋拍畹闹参锟共』?盡管它們所抵抗的病原物的種類千差萬(wàn)別,但在結(jié)構(gòu)上具有一定的共性,如含有亮氨酸重復(fù)序列(leucine-richrepeat,LRR)也支持了配體-受體模式的假說(shuō)?，F(xiàn)已克隆的來(lái)自病毒、細(xì)菌及真菌的無(wú)毒基因(Avr)的序列分析表明,它們彼此之間相似性很小,大部分Avr基因可以編碼專一性的激發(fā)子蛋白(elicitorprotein),Avr基因的多樣性決定了基因?qū)蚩剐赃M(jìn)化理論中寄主植物的對(duì)病原物的專一性識(shí)別。目前與抗病基因相應(yīng)的無(wú)毒基因的克隆,也為研究配體與受體模式提供了可能(Yangetal.,1997;deWitetal.,1999;Ellisetal.,2000andWhiteetal.,2000)。盡管如此,在酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)明之前,植物抗病蛋白與病原物無(wú)毒蛋白之間是否真正發(fā)生結(jié)合,一直缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持。1996年利用酵母雙雜交系統(tǒng)在植物抗病蛋白與病原物無(wú)毒蛋白相互作用研究領(lǐng)域已取得了重大突破,目前利用酵母雙雜交技術(shù)已驗(yàn)證了5對(duì)抗病蛋白與無(wú)毒蛋白之間的直接互作和3對(duì)蛋白之間的間接互作。1.1受刺激物和無(wú)毒物質(zhì)之間的直接比較1.1.1pto蛋白的鑒定番茄抗葉斑病的Pto基因是國(guó)際上克隆的第一個(gè)符合Flor基因?qū)驅(qū)W說(shuō)意義上的植物抗病基因(Martinetal.,1993)。1996年美國(guó)科學(xué)家利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證了番茄抗葉斑病的Pto蛋白與其相對(duì)應(yīng)的葉斑病菌Pseudomonassyringaepv.tomato中AvrPto無(wú)毒蛋白之間可以發(fā)生特異性的結(jié)合,同時(shí)證實(shí)Pto蛋白在204位上的蘇氨酸對(duì)于與AvrPto蛋白的專一性識(shí)別是必不可少的(Tangetal.,1996;Scofieldetal.,1996)。Pto與AvrPto蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的直接互作結(jié)合,首次為Flor基因?qū)驅(qū)W說(shuō)提供了分子水平上的實(shí)驗(yàn)證據(jù),對(duì)于寄主與病原物相互識(shí)別作用機(jī)制的研究具有劃時(shí)代的意義。1.1.2pi-ta與avr-pita蛋白的相互作用與水稻抗稻瘟病基因Pi-ta存在基因?qū)蜿P(guān)系的無(wú)毒基因是Avr-Pita,Jiaetal.(2000)證實(shí)Avr-Pita蛋白在酵母雙雜交及體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)中均可與Pi-ta蛋白的亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(LRD)結(jié)合,Pi-ta蛋白LRD結(jié)構(gòu)域或Avr-Pita中單個(gè)氨基酸的缺失均可導(dǎo)致蛋白結(jié)合的破壞及植物抗病性的喪失。表明Pi-ta與Avr-Pita的直接結(jié)合觸發(fā)了Pi-ta介導(dǎo)的抗病性。1.1.3利用基因組織特點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞中rars1-r-pcr的表達(dá)RRS1是從擬南芥中克隆的第一例具有TIR-NBS-LRR結(jié)構(gòu)的隱性抗病基因,但它在轉(zhuǎn)基因植物中表現(xiàn)為顯性,將其定義為抗病基因還主要基于以下一些特點(diǎn):(1)序列與其它抗病基因相似,編碼的蛋白屬于TIR-NBS-LRR結(jié)構(gòu);(2)它是SA途徑和NDR1信號(hào)傳導(dǎo)元件所必需的;(3)在攜帶有RRS1-S的感病品種中導(dǎo)入RRS1-R后,再接種青枯病菌不能發(fā)病。Deslandesetal.(2003)研究發(fā)現(xiàn),RRS1抗病蛋白與青枯病菌分泌的typeⅢ效應(yīng)子PopP2蛋白在雙雜交實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)生互作結(jié)合,PopP2與抗病蛋白R(shí)RS1共定位在細(xì)胞核中,并且RRS1在核中的位置取決于PopP2的存在。隨后Lahayeetal.(2004)對(duì)RRS1與PopP2的識(shí)別過(guò)程進(jìn)行了推測(cè),構(gòu)建了簡(jiǎn)單的模型。1.1.4煙草n基因的識(shí)別煙草N基因與煙草花葉病毒(TMV)之間的關(guān)系也符合基因?qū)驅(qū)W說(shuō),Uedaetal.(2006)利用酵母雙雜交及體外結(jié)合pull-down方法,驗(yàn)證了N蛋白與TMV的P50結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合,并且這種相互作用必須有ATP的參與。煙草N基因?qū)MV的識(shí)別過(guò)程涉及幾個(gè)步驟,首先ATP與N蛋白形成復(fù)合物,N蛋白與p50結(jié)合后增強(qiáng)了ATP的水解,形成的ADP/N復(fù)合物的空間構(gòu)像發(fā)生變化,便于與下游的信號(hào)傳導(dǎo)元件相互作用。這一模式構(gòu)成了理想的蛋白核心“proteinmachine”。1.1.5蛋白序列的可變性分析亞麻抗銹病基因L5、L6和L7與相對(duì)應(yīng)的銹菌無(wú)毒基因AvrL567之間存在基因?qū)蚧プ麝P(guān)系,Doddsetal.(2006)利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證了L5、L6和L7抗病蛋白與AvrL567無(wú)毒蛋白之間的直接互作,并且它們之間的直接識(shí)別作用涉及了抗病基因及無(wú)毒基因位點(diǎn)高度的遺傳多樣性,AvrL567位點(diǎn)基因序列的可變性,決定了與不同抗病基因間識(shí)別的專一性。L5、L6和L7與AvrL567之間的關(guān)系再次驗(yàn)證了抗病基因與無(wú)毒基因協(xié)同進(jìn)化的觀點(diǎn)。1.2抗病性蛋白質(zhì)與無(wú)毒蛋白之間的間接關(guān)系在多數(shù)植物-病原物互作系統(tǒng)中尚未找到抗病蛋白與無(wú)毒蛋白直接結(jié)合的證據(jù),但已發(fā)現(xiàn)有些抗病蛋白與無(wú)毒蛋白復(fù)合體的形成需要其它蛋白的參與。1.2.2avr9-habs-cf9的互作關(guān)系具有胞外結(jié)構(gòu)的番茄抗葉霉病(Cladosporiumfulvum)Cf-9是較早克隆的植物抗病基因,與之相對(duì)應(yīng)Avr9無(wú)毒基因也被克隆,但利用多種方法也未鑒定出它們之間的互作關(guān)系。Ludereretal.(2001)報(bào)道,利用標(biāo)記的Avr9在番茄中捕捉到了一個(gè)高度親和結(jié)合位點(diǎn)HABS蛋白可以與之結(jié)合。Avr9-HABS-Cf9三方互作將激活防御反應(yīng)。HABS蛋白在煙草等茄屬植物中也有文獻(xiàn)佐證。1.2.3tip蛋白和cp體外蛋白R(shí)enetal.(2000)利用酵母雙雜交系統(tǒng),從擬南芥中捕獲到與芫菁皺縮病毒TCV病毒外殼蛋白CP結(jié)合的TIP蛋白,TIP蛋白屬于NAC蛋白家族,參與植物胚的形成及開(kāi)花過(guò)程的調(diào)控。CP外殼蛋白與TIP蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明,TIP-CP相互作用的喪失直接影響了寄主植物對(duì)TCV病毒的抗性。說(shuō)明抗病基因HRT所介導(dǎo)的對(duì)TCV病毒的抗性,需要TIP蛋白與病毒外殼蛋白的結(jié)合,這種結(jié)合導(dǎo)致了擬南芥防御相關(guān)基因的表達(dá)。2防御反應(yīng)生物學(xué)中具有結(jié)構(gòu)和功能的動(dòng)物基植物在與病原物進(jìn)行識(shí)別后,觸發(fā)不同的早期信號(hào)傳導(dǎo),誘導(dǎo)產(chǎn)生的防御反應(yīng)包括信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)以及快速激活基因的表達(dá),研究發(fā)現(xiàn),植物與動(dòng)物中的防御信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中某些因子在結(jié)構(gòu)和功能上具有相似性。2.1番茄抗病性信號(hào)的傳播方法2.1.1pto基因突變體誘導(dǎo)抗體建構(gòu)的應(yīng)途徑自1993年第一例來(lái)自番茄的植物抗病基因Pto問(wèn)世以來(lái),陸續(xù)從不同作物中克隆的50多例抗病基因,其中來(lái)自水稻、大麥和擬南芥的Xa21、Rpg1和PBS1基因是為數(shù)不多的幾例編碼蛋白激酶結(jié)構(gòu)的抗病蛋白。激酶通過(guò)磷酸化和脫磷酸化的過(guò)程在生物信號(hào)傳導(dǎo)中扮演著重要角色,對(duì)上述具有激酶結(jié)構(gòu)域抗病蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究,對(duì)于解析由抗病蛋白所觸發(fā)的一系列防御反應(yīng)途徑具有重要意義。利用酵母雙雜交系統(tǒng)在以Pto抗病蛋白為核心的信號(hào)傳導(dǎo)鏈中先后鑒定出多種重要的蛋白元件,已初步勾勒出了Pto抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑的線條。Zhouetal.(1995)利用酵母雙雜交系統(tǒng)從番茄基因文庫(kù)中“釣”出了與Pto蛋白互作的蛋白Pti1。Pti1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,已經(jīng)被證實(shí)是Pto蛋白激酶專一性磷酸化作用的底物。Salmeronetal.(1996)利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究證實(shí)了Pto蛋白功能的發(fā)揮與另一個(gè)抗病蛋白Prf(具有NBS-LRR結(jié)構(gòu))密不可分,認(rèn)為Prf蛋白可能是Pto激酶磷酸化的直接作用底物。Zhouetal.(1997)利用Pto為誘餌,利用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定了3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白Pti4/5/6,它們病程相關(guān)蛋白(PR)啟動(dòng)子區(qū)域的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,作為Pto蛋白激酶的磷酸化底物,Pti4受乙烯和茉莉酸的誘導(dǎo),推測(cè)Pto蛋白激酶通過(guò)與PRbox結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的互作調(diào)控番茄防御基因的表達(dá)(Jiaetal.,1999;Guetal.,2000)。不同蛋白在番茄抗病信號(hào)傳導(dǎo)中扮演了不同的角色,并通過(guò)一系列的串連激活反應(yīng)最終使番茄產(chǎn)生抗病性,抗病反應(yīng)的多途徑、多分支由此可見(jiàn)一斑。2.1.2cf-9基因的c-末端誘導(dǎo)的誘導(dǎo)效果番茄抗葉霉病(Cladosporiumfulvum)的Cf家族抗病基因Cf-2、Cf-4、Cf-5和Cf-9所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,不含核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS),僅有胞外LRR結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域TM,但同樣具有對(duì)病原菌專一性識(shí)別及信號(hào)傳導(dǎo)的功能(Jonesetal.,1994;Thomasetal.,1997;Dixonetal.,1998)。番茄中的Cf抗病基因家族為一系列同源基因,它們分別對(duì)攜帶不同無(wú)毒基因的小種產(chǎn)生抗性。位于胞外的LRR結(jié)構(gòu)可能對(duì)病菌專一性識(shí)別發(fā)揮了作用。Cf抗性基因位點(diǎn)由一系列同源基因組成,序列分析比較發(fā)現(xiàn),Cf蛋白的羧基端的序列十分保守,不可能擔(dān)負(fù)對(duì)復(fù)雜多變的不同病原菌小種的識(shí)別任務(wù),所以推測(cè)對(duì)病原菌的專一性識(shí)別可能是由位于細(xì)胞外的氨基末端上多變的LRR結(jié)構(gòu)所承擔(dān)(Ellisetal.,1998;Kruijtetal.,2005;Rivasetal.,2005)。Rivasetal.(2005)利用Cf-9基因位于胞質(zhì)內(nèi)的C-端為誘餌,在酵母雙雜交系統(tǒng)中捕獲到了與Cf-9互作的硫氧還蛋白CITRX(Cf-9-interactingthioredoxin)。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)實(shí)驗(yàn)顯示,Cf-9與CITRX之間的結(jié)合加速了番茄及煙草中由Cf-9/Avr9觸發(fā)的過(guò)敏性壞死反應(yīng),觸發(fā)了活性氧的積累、蛋白激酶活性的改變及防御相關(guān)基因的誘導(dǎo),增強(qiáng)了不含Cf基因感病寄主對(duì)葉霉病菌(Cladosporiumfulvum)的抗性。通過(guò)Cf-9的誘導(dǎo),CITRX扮演了一個(gè)細(xì)胞凋亡和防御反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子,這種反應(yīng)不受Cf-2的誘導(dǎo)。Cf-9基因的C-末端被CITRX所識(shí)別是啟動(dòng)負(fù)調(diào)控作用的前提,這也是第一篇有關(guān)硫氧還蛋白參與植物抗病性調(diào)控的報(bào)道。Rowlandetal.(2005)利用VIGS技術(shù),在番茄Cf介導(dǎo)的抗性反應(yīng)中鑒定出了Avr9/Cf-9誘導(dǎo)的蛋白激酶1(Avr9/Cf-9inducedkinase1,ACIK1),ACIK1絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是Cf-9/Avr9及Cf-4/Avr4介導(dǎo)的HR反應(yīng)所必需的蛋白,但在其它的抗性系統(tǒng),如Pto/AvrPto,Rx/PXV及N/TMV系統(tǒng)中并不需要該蛋白的參與。Nekrasovetal.(2005)根據(jù)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)CITRX可能作為一個(gè)連接體,在Avr9激活Cf-9胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域時(shí)起一個(gè)補(bǔ)充作用,在這種相互作用中并不需要CITRX和ACIK1蛋白的催化作用。2.2公體上的基因表達(dá)擬南芥的EDS1和PAD4基因編碼脂肪酶類蛋白,Feysetal.(2001)年研究發(fā)現(xiàn),它們?cè)诳共』蚪閷?dǎo)的抗病性反應(yīng)中起重要作用。EDS1與植物的HR反應(yīng)有關(guān),水楊酸途徑與EDS1和PAD4密不可分。酵母雙雜交分析揭示出EDS1能夠與PAD4相互作用形成二聚體。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中EDS1和PAD4蛋白在健康的及病原菌誘導(dǎo)的植物細(xì)胞中均可發(fā)生相互作用。擬南芥的NPR1基因是系統(tǒng)獲得性抗病性(systemicacquiredresistance,SAR)及水楊酸(salicylicacid,SA)途徑關(guān)鍵的調(diào)控因子,為了研究NPR1的功能,Chernetal.(2005)將擬南芥的NPR1基因在水稻中過(guò)量表達(dá),轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的抗性增強(qiáng),且NPR1在mRNA水平上的積累與抗病性直接相關(guān)。在酵母雙雜交系統(tǒng)中篩選獲得了與NPR1互作的4個(gè)屬于bZIP家族的蛋白編碼基因rTGA2.1,rTGA2.2,rT-GA2.3和rLG2,它們與擬南芥中的TGA2基因的相似率在75%~81%。NPR1與rTGA2.1之間的互作在體外的pull-down實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步證實(shí)。這是首例擬南芥NPR1基因可以增強(qiáng)單子葉植物抗病性的報(bào)道,說(shuō)明單子葉和雙子葉植物中NPR1介導(dǎo)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有一定的保守性。擬南芥的基因組含有6個(gè)NPR1相關(guān)的基因,NPR4與NPR1的同源性只有36%,但是在雙雜交系統(tǒng)中,它們能夠與一系列相同的TGA轉(zhuǎn)錄因子互作。突變?cè)囼?yàn)證實(shí),NPR4是植物抵抗病原物基礎(chǔ)防御反應(yīng)所必不可少的蛋白,在SA與茉莉酸(JA)途徑信號(hào)傳導(dǎo)鏈中存在一定的交叉(Liuetal.,2005)。Kimetal.(2002)年研究發(fā)現(xiàn),與NPR1互作的TGA5在轉(zhuǎn)基因植物中高水平的表達(dá),使得擬南芥對(duì)由卵菌綱真菌引起的霜霉病(Peronosporaparasitica)的抗性大大增強(qiáng)。RAR1是與多種植物抗病基因介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中處在早期的信號(hào)中心,Azevedoetal.(2002)報(bào)道RAR1能夠與調(diào)節(jié)細(xì)胞循環(huán)的SGT1蛋白發(fā)生互作,RAR1-SGT1復(fù)合物也能夠與2個(gè)COP9信號(hào)元件互作,構(gòu)成了植物抗病反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)鏈。Takahashietal.(2003)年利用酵母雙雜交技術(shù)又鑒定出一個(gè)與RAR1互作的熱激蛋白90(heashockprotein90,HSP90),RAR1與HSP90含有AT-Pase的N基端結(jié)合,HSP90也能夠?qū)Ｒ恍缘嘏cSGT1結(jié)合,在擬南芥中HSP90抑制子可以降低HR反應(yīng)并破壞由RPS2抗病基因介導(dǎo)的對(duì)葉斑病的抗性,認(rèn)為RAR1與SGT1在抗病反應(yīng)中功能的發(fā)揮與HSP90蛋白密切相關(guān)。擬南芥的MAP蛋白激酶4(MPK4)是植物防御反應(yīng)的調(diào)控因子,也是調(diào)控SA和JA途徑防御基因表達(dá)所必需的蛋白。Andreassonetal.(2005)對(duì)MPK4信號(hào)傳導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn),MKS1是MPK4蛋白的作用底物,在基因組范圍內(nèi)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)錄框架進(jìn)行了全面的分析,發(fā)現(xiàn)SA抗病途徑完全依賴于MKS1蛋白,MKS1在野生型植物中的過(guò)量表達(dá)可激活SA介導(dǎo)的抗病反應(yīng)。利用雙雜交技術(shù)又進(jìn)一步捕獲到了與MKS1互作的WRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKY25和WRKY33。MKS1在MPK4調(diào)控WRKY轉(zhuǎn)錄因子激活的防御反應(yīng)中扮演著十分重要的角色。目前國(guó)際上對(duì)植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)的研究主要集中在模式植物番茄和擬南芥中,在其它作物中得研究還十分有限。目前利用酵母雙雜交技術(shù)在馬鈴薯和水稻抗病信號(hào)傳導(dǎo)研究中取得了初步進(jìn)展。2.3種ap1蛋白互通Fengetal.(2003)從馬鈴薯抗病資源材料MS-42.3中分離獲得了具有體外抑菌活性的抗菌蛋白AP1。采用酵母雙雜交系統(tǒng),以AP1蛋白為誘餌,從MS-42.3cDNA文庫(kù)中篩選獲得了幾種與AP1發(fā)生互作的,其中4種重要的蛋白有(1)蛋白激酶通過(guò)磷酸化將信號(hào)傳遞給下游的元件;(2)ATP合成酶b-亞基,為代謝及信號(hào)傳導(dǎo)提供能量;(3)乙烯受體蛋白,是乙烯介導(dǎo)的抗病途徑中重要的受體蛋白;(4)定位在葉綠體中的鐵硫蛋白,早期的膠體金標(biāo)記定位研究發(fā)現(xiàn),AP1蛋白在葉綠體中有較多沉積。說(shuō)明AP1蛋白功能的發(fā)揮可能涉及與葉綠體中蛋白的互作(馮潔等,2004)。推斷AP1蛋白的表達(dá)和抗病信號(hào)傳導(dǎo)與葉綠體蛋白有密切關(guān)系,涉及乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑及與能量代謝有關(guān)的蛋白。2.4osk3蛋白激酶在水稻誘導(dǎo)的亞基水稻中目前已克隆了5種SNF-1類蛋白激酶,命名為OSK1-5,它們主要與水稻對(duì)環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)壓力等逆境的反應(yīng)有關(guān)。Kimetal.(2000)年報(bào)道,稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)接種水稻后可造成OSK3的強(qiáng)烈表達(dá),說(shuō)明OSK3蛋白激酶可能參與了植物的抗病性。OSK3蛋白激酶由3個(gè)亞基組成,蛋白激酶做為α亞基,β和γ亞基對(duì)α亞基起調(diào)控作用。以水稻OSK3蛋白激酶為誘餌,利用酵母雙雜交系統(tǒng)(1)從水稻cDNA文庫(kù)中篩選獲得了3個(gè)與OSK3蛋白激酶互作的β亞基,并克隆了全長(zhǎng)基因;(2)發(fā)現(xiàn)OSK3蛋白激酶可與2個(gè)Ras轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和Myc類轉(zhuǎn)錄蛋白之間結(jié)合;(3)證明OSK3蛋白激酶與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶互作;(4)捕獲了位于OSK3蛋白激酶下游的產(chǎn)生活性氧(ROS)的草酸氧化酶(Fengetal.,2003)。草酸氧化酶可氧化草酸產(chǎn)生H2O2,通過(guò)多種方式在植物抗病反應(yīng)中起到對(duì)病原菌產(chǎn)生直接的殺傷作用、使細(xì)胞壁糖蛋白形成氧化交聯(lián)降低細(xì)胞壁對(duì)病菌產(chǎn)生的降解酶的敏感度及誘導(dǎo)SAR的產(chǎn)生及協(xié)調(diào)過(guò)敏性壞死反應(yīng)等(Levineetal.,1994;Wuetal.,1995)。因此,草酸氧化酶作為水稻OSK3蛋白激酶的信號(hào)傳導(dǎo)下游,直接參與水稻的抗病反應(yīng)。3酵母雙雜交無(wú)法確定蛋白質(zhì)互作的最容易取得性酵母雙雜交系統(tǒng)以其靈敏性、簡(jiǎn)便性及廣泛性等特點(diǎn)而被應(yīng)用到諸多方面的研究,但該系統(tǒng)具有其自身的局限性。首先是不能檢測(cè)所有蛋白間的互作,如(1)不能檢測(cè)需要3個(gè)或3個(gè)以上蛋白結(jié)合的相互作用;(2)不適合檢測(cè)涉及膜蛋白的相互作用;(3)有些誘餌蛋白表達(dá)后,會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒性,不適合做誘餌基因。盡管存在上述缺陷,但酵母雙雜交系統(tǒng)仍是目前所建立的鑒定蛋白質(zhì)互作最標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)。目前在酵母雙雜交系統(tǒng)基礎(chǔ)上衍生出的其它雜交系統(tǒng)也都有其特定的適用范圍。其次是假陽(yáng)性的存在,即通過(guò)雙雜交觀察到的蛋白質(zhì)的相互作用在真實(shí)情況下不一定發(fā)生,但目前新系統(tǒng)中由于將多個(gè)報(bào)告基因組合在一起,可以基本消除假陽(yáng)性。再次是假陰性的問(wèn)題,即在生物體內(nèi)可發(fā)生蛋白間的相互作用,但由于種種原因在雙雜交系統(tǒng)中觀察不到,如(1)有些蛋白之間的互作對(duì)載體構(gòu)建時(shí)細(xì)小的變化十分敏感,對(duì)所采用的雙雜交系統(tǒng)有偏好;(2)蛋白在酵母中表達(dá)過(guò)量時(shí),造成空間的積壓,影響了蛋白間的專一性互作;最后,蛋白質(zhì)間的相互作用還必須結(jié)合其它手段加以驗(yàn)證,如體外Pull-down及免疫共沉淀技術(shù)(co-immunoprecipitation)等。4價(jià)格補(bǔ)充4.1dna地面-基因表達(dá)框架基因組學(xué)(genomic)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomic)合在一起,統(tǒng)稱為omic,它們的結(jié)合有助于在全基因組水平上分析細(xì)胞信號(hào)、基因表達(dá)框架及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,盡管DNAmicroarray技術(shù)已被證實(shí)在分析蛋白質(zhì)的功能、信號(hào)傳導(dǎo)途徑方面具有顯而易見(jiàn)的優(yōu)勢(shì),但基因的功能需要通過(guò)它們的蛋白產(chǎn)物的活性來(lái)加以證實(shí)。因此,蛋白的分析也同樣被期待可產(chǎn)生許多的信息,將它們組合在一起,構(gòu)成一個(gè)完整的拼圖板。雙向電泳、質(zhì)譜及蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣(microarrays)方法相繼涌現(xiàn),使得大規(guī)模分析蛋白質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)途徑成為可能。4.2酵母蛋白互作網(wǎng)絡(luò)