GAF結構域的分類、結構及功能-生物化學論文-生物學論文

GAF結構域的分類、結構及功能-生物化學論文-生物學論文——文章均為WORD文檔，下載后可直接編輯使用亦可打印——

摘要：GAF結構域廣泛存在于各種蛋白中,其主要通過結合環(huán)核苷酸cGMP、cAMP、生色團和血基質等小分子作為信號分子、光或者氣味受體,配合其他調節(jié)結構域穩(wěn)定蛋白質構象和傳遞信號。本文簡要綜述了GAF結構域的基本特征、分類、結構及功能,為闡明一些重要信號轉導途徑及抗逆性研究提供了一定的理論依據(jù)。

關鍵詞：GAF結構域;信號轉導;光敏色素;磷酸二酯酶;腺苷酸環(huán)化酶;

Abstract：TheGAFdomainpresentinginvariousproteinsareinvolvedinmaintainingproteinconformationstabilityandsignaltransduction.TheGAFdomainoftenreceivesandtransducessignalsthroughbindingtosmallsignalmoleculessuchascGMP,cAMP,chromophoreandheme,andfunctionsaslightorodorreceptorsincompanywithotherregulationdomains.Inthispaper,thebasiccharacteristics,classification,structureandfunctionsofGAFdomainsaresummairzed,whichprovidestheorybasisfortheresearchesofthesignaltransductionpathwayandstressresistance.

Keyword：GAFdomain;signaltransduction;phytochrome;phosphodiesterase;adenylatecyclase;

GAF結構域是以最早被發(fā)現(xiàn)含有這個結構域的蛋白質來命名的，由特異性的cGMP磷酸二酯酶(cGMP-bindingphosphodiesterases)、腺苷酸環(huán)化酶(adenylylcyclases,AC)和細菌轉錄因子FhlA(formatehydrogenlyasetranscriptionactivator)的首字母構成。GAF結構域極少單獨出現(xiàn)，通常作為蛋白質的一部分參與信號轉導過程[1]。GAF結構域與信號分子的結合通常是接收和傳導化學信號，與發(fā)色基團的結合通常是接收物理信號(如光線)[2]。GAF結合的配體主要為環(huán)核苷酸cGMP和cAMP，此外反式甲硫氨酸亞砜、亞鐵血紅素、膽素、四吡咯[1]、氨基酸(如全局調控蛋白CodY的2個GAF結構域)也可以作為配體與GAF結合[2]。目前，已有利用X射線晶體衍射和核磁共振技術解析一些GAF結構域的研究報道，其中釀酒酵母YKG9蛋白的GAF結構域最先被解析[3];隨后，Martinez等[4,5]解析了小鼠磷酸二酯酶串聯(lián)GAF的晶體結構，并報道了藍細菌腺苷酸環(huán)化酶(adenylatecyclase,AC)CyaB2的串聯(lián)GAF結構。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDEs)的GAF結構域可作為藥物靶標開發(fā)[6];耐輻射奇球菌的光敏色素的GAF結構域在光轉化模型研究中可作為膽素結合位點[7,8,9]，在光遺傳學的研究中發(fā)揮著重要作用。

1、GAF結構域的分類

GAF結構域廣泛分布于多種蛋白質中，在細胞中主要起著信號受體的作用，很多種類的小分子包含一些信號分子和發(fā)光基團均可與之結合[10]。GAF結構域通常以串聯(lián)的形式存在，極少數(shù)情況下也可作為單獨功能的蛋白質出現(xiàn)。近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在一些光受體、氣味受體以及全局調控蛋白中也存在串聯(lián)GAF結構域。根據(jù)結合的配體不同，GAF結構域還可分為以下5個種類[11]。

1.1、光受體中的GAF

植物光敏色素是一種光受體，由N末端光感受區(qū)域和C末端信號傳導區(qū)域構成，N末端光感受區(qū)域主要由GAF結構域和Per-Arnt-Sim(PAS)結構域組成[10]。其中GAF結構域包含生色團的結合位點，PAS則主要負責調節(jié)光敏色素對不同波長光的響應[11]。在光合細菌、真菌中也相繼發(fā)現(xiàn)光受體-光敏色素，盡管細菌、真菌中的光敏色素在性質上與植物光敏色素差異較大，但二者GAF結構域的同源性較高[12]，說明GAF結構域作為光敏色素的重要組成成分，在進化中較保守。

1.2、氣體受體中的GAF

GAF結構域在植物乙烯信號途徑中具有特殊作用，擬南芥中的5個乙烯受體家族ETR1、ERS1、ETR2、EIN4和ERS2的基本結構均包含1個GAF結構域，在乙烯信號響應和傳導中發(fā)揮著重要作用[13,14]。GAF還可以通過氨基酸殘基與血基質結合，從而感受一些氣體信號，如結核分枝桿菌通過GAF結構域感受到宿主組織缺氧后會進入休眠期，進入持留狀態(tài)[15]。

1.3、環(huán)核苷酸受體中的GAF

環(huán)核苷酸(cylicnucleotides,cNMP)是機體內重要的小分子信號物質，GAF可作為cNMP的受體參與細胞內化學信號的傳導[16]。哺乳動物中較早發(fā)現(xiàn)的GAF結構為PDEs的串聯(lián)GAF-A/B，研究發(fā)現(xiàn)PDEs可以調節(jié)所有使用cGMP或cAMP作為第二信使的通路。目前已知的PDEs家族有11個，即PDE1～PDE11，且至少存在21個亞型[16]，其中，PDE2、PDE5、PDE6、PDE10和PDE11的氨基端都含有1對GAF-A/B結構[17,18,19]。AC存在于各種生物細胞中，其能在外界信號刺激和細胞內代謝變化條件下催化ATP(adenosinetriphosphate)生成cAMP(cyclicAMP)和焦磷酸(pyrophosphate,PPi)，從而調節(jié)機體各種生理反應[20,21]。藍細菌ACCyaB2的串聯(lián)GAF結構域含有1對GAF-A/B結構，其序列與PDEs串聯(lián)GAF結構的相似性較高，二者可實現(xiàn)部分功能的互換[21,22,23]。

1.4、具有單獨酶活性的GAF

GAF串聯(lián)結構域多數(shù)情況下主要以復雜蛋白的配體參與胞內外信號轉導，但在極少數(shù)情況下，單個的GAF結構域也可作為蛋白質發(fā)揮作用，如Lin等[15]研究發(fā)現(xiàn)一種新型的蛋氨酸亞砜(methioninesulfoxide,MetO)還原酶游離蛋氨酸R型亞砜還原酶(freemethioninesulfoxidereductase,fRMsr)，其長度為183個氨基酸殘基，作為一類重要的氧化還原調節(jié)蛋白參與細胞的防御和抗衰老過程。Pfam分析結果顯示，fRMsr只有1個長度為129個氨基酸殘基的GAF結構域，這是GAF家族中第1個被發(fā)現(xiàn)具有單獨酶活性的GAF結構域。

1.5、類GAF結構域

耐輻射奇球菌關鍵蛋白PprI(inducerofpleiotropicproteinspromotingDNArepair)的C末端與肺炎克雷伯菌傳感器組氨酸激酶CitA(histidinekinases,HK)和磷酸二酯酶2A(phosphodiesterase2A,PDE2A)的GAF結構域高度相似[24]，比較三者與檸檬酸鹽和cGMP配體組成的復合體結構，發(fā)現(xiàn)三者的配體結合位點和信號通路都有較高程度的重疊[25]，因此PprI的C末端也被稱為PprI的GAF結構域。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當去除PprI的C端，會導致耐輻射抗性大幅度下降，表明PprI的C末端可能在耐輻射響應機制中起著傳感器的作用[26]。

2、GAF結構域的結構

GAF結構域通常作為蛋白質的一部分，配合其他的調節(jié)結構域如PAS(Per-Arnt-Sim)結構域、HAMP(histidinekinases,adenylylcyclases,methybindingproteins,phosphatases)結構域以及各種感應調節(jié)結構域共同發(fā)揮作用[22]。蛋白一般含有1個GAF結構域或者1個串聯(lián)GAF結構域，極少情況下，細菌蛋白質存在3個及3個以上連續(xù)排列的GAF區(qū)域，如在聚球藻屬或厭氧粘細菌中參與多傳感器信號轉導的組氨酸激酶有6個GAF結構域[4]。GAF超家族是一類主要通過與配體分子結合來調節(jié)蛋白信號轉導的結構域集合，其家族成員的一級結構復雜多變，但大多數(shù)由150個左右氨基酸殘基組成，有類似的一些結構特征，其中哺乳動物PDEs和藍細菌ACCyaB2的串聯(lián)GAF結構域是典型代表[27,28]。

2.1、GAF結構域基本特征

GAF結構域均存在相似的三維折疊結構，N端和C端的1、2、3、5螺旋形成了結構的外層，無規(guī)則卷曲和短的4螺旋結構形成了相對外層，有6個中心反向平行的折疊，折疊形成的彎曲平面將螺旋分為兩部分[3]。反向平行的折疊形成的彎曲平面是配體結合口袋的基本結構，配體結合口袋的部分區(qū)域被3、4螺旋和一些環(huán)狀卷曲所覆蓋，2、5在配體結合口袋的另一面[15](圖1)。

圖1GAF三級結構[3]

Fig.1TertiarystructureofGAF[3]

2.2、2種經(jīng)典的串聯(lián)GAF結構域結構特征

GAF的結構域通常是以二聚體的形式出現(xiàn)，主要形成雙重對稱平行和反向平行2種結構。GAF二聚體結構域中最經(jīng)典的代表是哺乳動物磷酸二酯酶家族中的PDE2和藍細菌ACCyaB2，二者的GAF結構域都是串聯(lián)GAF結構域的形式[4]。所有結合環(huán)狀核苷酸的串聯(lián)GAFs均至少含有1個由5個氨基酸殘基NKX(5-24)FX3DE構成的基序(NKFDE基序)，此基序對GAF結構域的正確折疊起著重要作用，且大多數(shù)串聯(lián)GAF結構域中NKFDE的基序都是保守的。此外，在串聯(lián)GAF結構域的前端還存在一段較長的N端肽段，與串聯(lián)GAF結構域構成一個整體，并影響串聯(lián)GAF結構域與環(huán)核苷酸的親和力[3]。

PDE2的GAF的結構域是1個雙重對稱平行的二聚體(圖2-A)，主要包含兩大部分，即GAF-A和GAF-B，其中GAF-A和GAF-B被一個長的螺旋隔開，每個GAF-A結構域都彼此離得很近且似乎直接參與二聚反應，而GAF-B結構域是分開的[8]。在PDE2的串聯(lián)GAF中，GAF-A和GAF-B均包含NKFDE基序，通過該基序突變研究發(fā)現(xiàn)，每個GAF-B結構域結合1個cGMP，并將其完全淹沒在結合口袋中，而與GAF-B有著類似結構的GAF-A結構域不結合配體[22]，表明要結合或者釋放cGMP，這個結構域必須開放到一定程度并允許外部物質進入。

Martinez等[5]研究表明藍細菌ACCyaB2的串聯(lián)GAF結構的晶體分辨率為1.9，是1個反向平行的二聚體結構，與PDEs的串聯(lián)GAF結構域具有極高的序列相似性。二者的GAF-A和GAF-B結構域都是由32個氨基酸長度的螺旋連接，通過序列比對發(fā)現(xiàn)所有PDEs和AC串聯(lián)GAF結構域的這個螺旋長度基本相同[1]，表明這個螺旋對二聚體的形成至關重要[26]。相比PDE2的串聯(lián)GAF二聚體結構，ACCyaB2串聯(lián)GAF二聚體表面有不同的排列，在其反向平行構象中，1個蛋白中的GAF-A會與另一個蛋白的GAF-B形成并列式排布，且CyaB2串聯(lián)GAF的N端螺旋被折疊到二聚體中心，導致N端螺旋點和螺旋連接處的表面相互作用有所增強(圖2-B)。

圖2磷酸二酯酶PDE2(A)和腺苷酸環(huán)化酶CyaB2(B)串聯(lián)GAF的結構域[5]

Fig.2ThedomainofphosphodiesterasePDE2(A)andadenylatecyclaseCyaB2(B)inseriesGAF[5]

3、GAF結構域的功能

3.1、串聯(lián)GAF結構域的功能

3.1.1、光信號傳導

植物光敏色素作為植物中的光受體，通過接受光信號并將信號傳到光反應中心，然后將處理好的光信號通過光反應中心輸出途徑傳遞給下游分子，進而調控特異基因的表達。光敏色素主要通過GAF結構域的保守性半胱氨酸殘基與線性四吡咯色素分子的共價連接，形成具有光活性的色素蛋白，進行信號傳導，在植物生長發(fā)育、形態(tài)建成中發(fā)揮著重要作用[29]。藍細菌中感光蛋白主要通過GAF結構域或PAS結構域發(fā)揮與發(fā)色團結合、適當?shù)墓廪D換以及對從近紫外到可見光的廣泛光譜作出反應等功能[1]。在藍細菌感光蛋白中，結合色素的GAF結構域已經(jīng)具有完整的光活性，而植物光敏色素需要PAS結構域、GAF結構域和PHY結構域串聯(lián)結合在一起才具有完整的光活性[30,31]。

3.1.2、氣體信號轉導

擬南芥的5個乙烯受體基因(ETR1、ERS1、ETR2、EIN4和ERS2)可分為2個亞家族，通過下調乙烯反應基因來調節(jié)乙烯信號的輸出[32]。謝芳[33]研究表明，ETR1和ETR2兩個亞家族之間可以通過GAF結構域進行相互作用，轉導乙烯信號。Catal等[32]研究表明，ERS1受體中GAF結構域的點突變會導致擬南芥對微弱乙烯不敏感。病原體結核分枝桿菌在感受到宿主組織缺氧后會進入休眠期，其主要是通過DevRST操縱子系統(tǒng)進行響應。DevRST操縱子系統(tǒng)由雙組分信號轉導系統(tǒng)DevRS和DevT兩部分組成，其中DevRS由包含1對串聯(lián)GAF-A/B結構的組氨酸激酶DevS和反應調控子DevR組成，DevT2是1個信號感受蛋白。DevS的GAF-A通過H149A氨基酸殘基與血紅素的鐵原子協(xié)作，從而與血紅素結合，傳導氣體信號響應宿主組織缺氧[15]。

3.1.3、化學信號傳遞

哺乳動物PDEs的GAF結構域主要通過結合cNMP信號分子發(fā)揮作用，已知包含GAF-A和GAF-B結構的PDEs家族中，PDE5和PDE6的串聯(lián)GAF結構域特異性結合cGMP,PDE10特異性結合cAMP,PDE2和PDE11與cGMP、cAMP均能結合，cNMP通過結合GAF結構域激活PDEs的催化活性[17,34,35]。如恥垢分枝桿菌編碼了1種含有GAF結構域的酶DcpA，具有催化c-di-GMP合成和水解的雙功能，該酶的GAF結構域通過結合GDP，介導了其下游結構的二聚化反應，而二聚體對于DcpA酶的合成活性具有重要作用[36]。

3.1.4、藥物靶標開發(fā)

在磷酸二酯酶抑制劑藥物的開發(fā)中，一些PDE抑制劑在臨床得到了廣泛的應用，如PDE3抑制劑能用于治療心衰，PDE4抑制劑能用于治療呼吸道炎癥，PDE5抑制劑能用于治療男性勃起功能障礙等[37]。PDEs抑制劑通常直接作用于PDEs催化區(qū)域，從而抑制其酶活性，但在治療過程中會產生視覺障礙、頭痛、偏頭痛等副作用;但通過藥物靶向作用于PDE5的GAF結構域可有效抑制PDEs的激活，既間接抑制了PDEs的酶活，又消除了直接作用于PDEs催化區(qū)域帶來的副作用[12]。因此，哺乳動物PDEs中串聯(lián)GAF結構域可以作為藥物靶標進行開發(fā)。

3.2、串聯(lián)GAF結構域各組件的功能

GAF結構域通常以串聯(lián)的形式發(fā)揮功能，串聯(lián)GAF一般包括2個及以上GAF結構、N端、鏈接段。所有具有環(huán)核苷酸結合特征的串聯(lián)GAF結構域中都至少存在1～2個NKFDE基序，GAF結構域通常在一段較長的N端肽段之后，且N端肽段的長度存在差異[37]。研究表明，哺乳動物PDEs由cGMP激活其活性，而PDEs又可以水解cGMP，因此直接研究PDEs各組件的調節(jié)功能對試驗條件的要求極為嚴苛[38];而通過cAMP激活的藍細菌AC的底物是ATP，且AC和PDEs的GAF結構域有極高的相似性，二者可在功能上相互替換[39]。因此常利用PDEs和AC的嵌合體來研究PDEs各組件功能，通常下游酶活性區(qū)域來自AC，上游信號轉導結構域來自PDEs。

3.2.1、NKFDE基序的功能

串聯(lián)GAF結構域中，NKFDE基序位于串聯(lián)GAF結構域的GAF-A(PDE6和11)或GAF-B(PDE10)中，或者在2個GAF結構域中都有PDE2和PDE5以及腺苷酸環(huán)化酶CyaB1和CyaB2[40]。Ho等[3]對PDE5串聯(lián)GAF-A的NKFDE基序進行突變，結果表明，該基序突變導致GAF完全喪失結合以及調控環(huán)核苷酸的功能，而突變GAF-B中NKFDE基序無影響。這種突變方法常用于鑒別GAF-A和GAF-B結構域中哪一個負責配體結合和信號傳導。在大量注釋的GAF結構域中，對于結合cNMP的串聯(lián)GAF結構域，NKFDE基序可能是1個特征基序，但是絕大多數(shù)的GAF結構域配體尚未確定[41]。進一步研究表明，在串聯(lián)GAF結構域中，cNMP結合區(qū)域的正確折疊需要NKFDE基序，該基序并未直接參與cNMP結合，而是在形成結合腔時，起支持性的結構作用[22]，猜想這個基序可能在某種程度上與構象運動有關，或者可能控制結合口袋的打開和關閉[5,36,42]。

3.2.2、N端的功能

在串聯(lián)GAF結構域中，N端位于GAF結構域上游，Bruder等[41]和Gross-Langenhoff等[42]采用PDE5和PDE11替代藍細菌AC的GAF結構域和N端，研究嵌合體中PDE5和PDE11的N端功能，結果表明，PDE5和PDE11的N端參與了信號傳導，通過與GAF結構域的相互作用調節(jié)酶的活性。PDE5的N端肽段長度為148個氨基酸，在102位有1個絲氨酸，該位點磷酸化能增加PDE5與cGMP的親和力[41]。Bruder等[41]將N端逐漸截短至102位的絲氨酸，N端基本結構依然存在，且能與串聯(lián)GAF相互作用，此時藍細菌AC仍維持低水平的酶活，GAF結構域與cGMP的親和力也無明顯變化;但當從N端中去除102位氨基酸和更多氨基酸時，AC的活性增強，移除N端加入cGMP,AC活性可以達到最大。表明N端肽段與GAF之間通過復雜的相互作用抑制了AC的活性，cGMP介導的AC激活是通過將AC從抑制中釋放，而不是直接激活。

PDE11A4是PDE11家族中唯一包含完整串聯(lián)GAF結構域的剪接變異體，包含1對GAF-A/B結構域，N端的氨基酸長度為196，在其117和168位置有2個cNMP依賴性蛋白激酶的磷酸化位點(Ser-117,Ser-168)，任何一個位點磷酸化均可增加GAF-A與配體cGMP的親和力，降低激活AC所需的cGMP濃度[17]?？莶菅挎邨U菌CodY結合域有1個串聯(lián)GAF結構域，其N端與異亮氨酸結合時，CodY結合域的螺旋連接螺旋的結構域展開，增加了CodY與DNA結合的親和力[36,43]。因此，N端區(qū)域可能具有2種功能:一是影響串聯(lián)GAF結構域與cGMP的親和力，如PDE1A4的GAF-A結構域與cGMP的親和力;二是直接作用于催化活性區(qū)域，通過與串聯(lián)GAF結構域形成1個緊密的結構整體，影響配體結合區(qū)域的構象。

3.2.3、各GAF串聯(lián)結構域之間的關聯(lián)

串聯(lián)GAF結構域中研究較多的是包含2個GAF結構域GAF-A/B的情況，其中GAF-A和GAF-B可能具有不同的功能，但二者在結構和功能上存在相互作用。解析的小鼠PDE2全酶亞基端串聯(lián)GAF-A/B的晶體結構顯示，每個GAF-B域結合1個cGMP從而進行酶活性與構象調節(jié)，而與GAF-B有著類似結構的GAF-A結構域不結合配體，主要發(fā)揮促進單體二聚化的功能[2]。Xu等[23]研究表明，哺乳動物PDE2和藍細菌ACCyaB1的串聯(lián)GAF能實現(xiàn)部分功能互換，若用PDE2的串聯(lián)GAF結構域整體替換ACCyaB1的串聯(lián)GAF結構域，可將cAMP激活酶改造成cGMP調節(jié)酶。這種功能替換在PDE5、PDE10和PDE11串聯(lián)GAF也得到驗證[23]。然而，只包含PDE5的1個GAF結構域(GAF-A或B)的ACCyaB1嵌合體并不具備調節(jié)功能，表明用于功能信號的本質是需要串聯(lián)GAF的2個結構域[41]。

Hofbauer等[44]利用PDE5和PDE10的N端、GAF-A、GAF-B以及二者之間的鏈接段這4個部分組合成最可能的10種嵌合體，嵌合體下游來自藍細菌AC，主要作為信號輸出結構域，發(fā)現(xiàn)部分嵌合體可以被激活。在PDE5的N端、GAF-A、和PDE10的鏈接段、GAF-B組成的嵌合體中，能觀察到cAMP和cGMP的信號傳導，從而激活下游AC活性;但若將GAF-B的NKFDE基序進行D/A突變，會消除cAMP或cGMP的激活效應;將PDE10的鏈接段替換為PDE5的鏈接段也會完全消除嵌合體的信號傳導。這表明GAF-A和GAF-B之間存在結構和功能的相互作用，且鏈接段可以將GAF結構域內部元件通過特異性的相互作用連接成有功能的整體[4,5]。因此，在串聯(lián)GAF結構域中，GAF-A、螺旋鏈接及GAF-B是一個高度有序的整體，且彼此之間存在特定的相互作用。

4、結論與展望

GAF結構域作為生物體中重要的受體模塊之一，通過與cGMP、cAMP、環(huán)狀鳥苷酸等分子的結合進行信號轉導。而GAF結構域通常是以串聯(lián)的形式參與各種信號途徑，在PDEs、藍細菌ACs、植物光敏色素等信號轉導中，串聯(lián)排列的GAF結構域均具有重要作用。單獨的GAF結構域則必須以二聚體形式發(fā)揮功能，且主要起調節(jié)相關酶活性的功能。在磷酸二酯酶抑制劑藥物的開發(fā)中，哺乳動物PDEs中串聯(lián)GAF結構域可作為藥物靶標進行檢測，為哮喘、自身免疫、炎性等疾病的治療提供幫助[18,41,45,46]。近年來在光遺傳學研究中發(fā)現(xiàn)，GAF結構域作為植物光敏色素的重要組成部分，在光轉化模型的構建中發(fā)揮著重要作用[45]。最近浙江大學分子生物物理實驗室研究發(fā)現(xiàn)GAF類似結構域在細菌耐輻射和DNA損傷修復中也可能具重要功能(未發(fā)表)。同時，有些共性問題尚亟待解決，如當腺嘌呤和鳥嘌呤進入GAF結構域結合區(qū)域時，GAF結構域如何識別和區(qū)分它們;其構象如何改變以便將配體完全包圍以及最終如何激活磷酸二酯酶、腺苷酸環(huán)化酶等重要蛋白。因此，仍需對GAF結構域進行更深入的研究。

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