重金屬對(duì)有效微生物DNA的損傷

重金屬對(duì)有效微生物DNA的損傷：對(duì)廢水處理的影響摘要：本研究是為了測(cè)試重金屬離子As3+、Cd2+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Pb2+和Zn2+對(duì)有效微生物(EMs)DNA的損傷，以及DNA被損傷的EM菌對(duì)污水處理能力的影響。本研究中的方法是在不同濃度的重金屬離子As3+、Cd2+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Zn2+對(duì)EM細(xì)菌DNA的損傷進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，以及EM菌在受到As3+、Cd2+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Pb2+和Zn2+影響后對(duì)廢水COD的降解能力。結(jié)果表明：EM菌DNA的損傷與其廢水處理能力呈負(fù)相關(guān)性，它能承受重金屬離子的最大濃度分別為As3+0.05mg/L、Cd2+0.5mg/L、Cr3+0.5mg/L、Cu2+0.5mg/L、Hg2+0.2mg/L、Pb2+1mg/L、Zn2+1mg/L。關(guān)鍵詞：有效微生物；重金屬；DNA損傷；廢水序言：在生化處理廢水過(guò)程中，無(wú)論重金屬是呈分子形式還是離子形式，都不能被微生物降解。尤其是重金屬的可溶性形式是有毒的，因?yàn)樗话闶窃趧?dòng)植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，并且可以在這些生物物種中積累，包括人類。同樣的，重金屬參與許多化學(xué)反應(yīng)。它們的狀態(tài)形式，可以從可溶性到不溶性，從化合態(tài)到自由態(tài)。對(duì)長(zhǎng)江一中國(guó)最長(zhǎng)河流的水質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)臨近它的城市的水都受到重金屬污染的影響。此外，水中重金屬的濃度影響到其是否適用于市政(ZhuandZang,2001)。同樣的，黃河一中國(guó)第二長(zhǎng)的河流，也發(fā)現(xiàn)它被重金屬污染了，在樣品中發(fā)現(xiàn)重金屬的總濃度幾乎達(dá)到總污染物的12.96%(Ma，2002)。遺憾的是不僅僅是河流，在整個(gè)中國(guó)，重金屬污染是一個(gè)很普遍的現(xiàn)象。因?yàn)槭澄锔N占地面積大，所以它也受到影響(WeiandChen,2001;Sunetal.,2003)。含有重金屬的水通過(guò)給植物灌溉或者是污水的不適當(dāng)?shù)奶幚磉M(jìn)入到人類的食物中(DongandChen,1982;Kowetal.,1998;Cobbertt,2002;Tsujetal.,2002)。有幾種方法用來(lái)處理重金屬污染廢水，包括物理、化學(xué)和生物方法(Erokhinetal.,2006)。廣泛使用的物理方法包括活性炭吸附法和電極法?；瘜W(xué)方法包括酸化、離子交換、溶液化和使用表面活性劑和絡(luò)合劑(Barradoetal.,2001;S'anchezetal.,2006)。另一方面，生物方法主要是對(duì)重金屬抗性菌的培養(yǎng)和馴化(Chelliahetal.,2006;Sofiaetal.,2006)。在生物處理過(guò)程中，有效微生物(EMs)是被認(rèn)為去除包括重金屬的最有效的方法。有效微生物這個(gè)術(shù)語(yǔ)是日本琉球大學(xué)TeruoHiga提出的(TeruoandJames,1994)。他用這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括了那些在各種各樣的環(huán)境下有效并且有益的微生物。最初，輝夫和詹姆斯(1994)調(diào)查了對(duì)農(nóng)業(yè)作物有益的微生物，因?yàn)樗麄兛吹接盟鼈兲娲屎娃r(nóng)藥使用，這個(gè)想法最后擴(kuò)展到畜牧業(yè)生產(chǎn)中。這些優(yōu)點(diǎn)被人用來(lái)改進(jìn)牲畜的污水的質(zhì)量。目前，有效微生物正被用到豬、牛、奶牛和家禽養(yǎng)殖中。輝夫和詹姆斯（1994）也發(fā)現(xiàn)有超過(guò)80種有益微生物。這些主要是厭氧細(xì)菌種，乳酸菌，酵母菌和放線菌。除了農(nóng)業(yè)，有效微生物按照輝夫和詹姆斯提出的水質(zhì)凈化標(biāo)準(zhǔn)也被運(yùn)用到清潔受污染的河道、湖泊、瀉湖和化糞池，以及廢水處理廠和垃圾填埋場(chǎng)中。可是，這些有效微生物會(huì)因?yàn)橹亟饘俚拇嬖诙艿接绊?。盡管這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)被確認(rèn)，在這個(gè)方面進(jìn)行了一些研究。具體來(lái)說(shuō)，在傳統(tǒng)的活性污泥法的過(guò)程中，重金屬濃度的危害在于在重金屬所造成的沉重中限制EMs在活性污泥法處理的效率。但是，有效微生物的DNA的損傷與它的處理效率間的聯(lián)系尚未研究。目前認(rèn)為對(duì)有效微生物損傷的一種形式是對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷。用來(lái)調(diào)查這一特定類型損傷的一種方法是單細(xì)胞凝膠電泳或彗星實(shí)驗(yàn)。這種方法具有快速的、敏銳的和相對(duì)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。隨著典型的單細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)方法（KumaravelandAwadheshe,2006;Singhetal.,1988），它結(jié)合了簡(jiǎn)單的檢測(cè)單鏈DNA分裂的生化技術(shù)（鏈斷裂和不完整的切除修復(fù)位置），以及堿基的不穩(wěn)定位置和交叉鏈接。在這項(xiàng)研究中，對(duì)引起有效微生物的遺傳物質(zhì)的損傷的各種重金屬的濃度范圍進(jìn)行了研究。同樣地，對(duì)含有不同重金屬濃度污水的微生物處理效能也進(jìn)一步調(diào)查。1、 材料和方法1.1、 試劑及化學(xué)藥品廢水水樣是從中國(guó)廣州華南理工大學(xué)的一間食堂的污水管道中獲得。試劑有銅、鋅、鉛、鎘的稀溶液，和硫酸汞，以及A203和CrCl3。有效微生物從廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獲得。 23 31.2、 測(cè)定細(xì)菌在重金屬污染下存活數(shù)量在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，取5000ml的污水靜止30min。去除上清液，保留原液3000ml。搖晃均勻后將水樣平均分裝到6個(gè)瓶子里去（每個(gè)500ml）。五個(gè)樣品中加入一種重金屬，并且每個(gè)樣品中的劑量不同，剩下一個(gè)作為空白試驗(yàn)。5個(gè)樣中每個(gè)加入0.5ml的EM溶液，振蕩，再用泵AR-6500低流量曝氣24h。然后，取出1ml的溶液，稀釋108倍后，取樣分布在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在28°C經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)，對(duì)微生物的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)劑量樣品上菌落數(shù)與空白樣中菌落數(shù)的比例作為重金屬的存在的有效微生物指數(shù)。這個(gè)過(guò)程重復(fù)5次，計(jì)算出每個(gè)濃度放入平均比例。此后，將每個(gè)重金屬重復(fù)整個(gè)過(guò)程。每次濃度的增加量如表1中所示。1.3、 COD量減少的測(cè)定未經(jīng)處理得污水最初的化學(xué)需氧量（COD）是采用中國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局

標(biāo)準(zhǔn)方法（SEPAC,2000）測(cè)定。這個(gè)過(guò)程是在溶液靜止30min后取上清液后完成。在培養(yǎng)完后同樣測(cè)定6個(gè)樣品的COD。計(jì)算每次處理后COD的減少量，取每次處理5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。表1重金屬對(duì)EMs的DNA的損傷影響及他們的存活率重金屬離子劑量（mg/L）空白（沒(méi)損傷）低損傷中損傷高損傷DNA細(xì)胞損傷率（％）AUEM的存活率（%）CU2+0100100111000.10771562234890.60.505228146487478.61.003836188629670.65.00204032188015825.310.00040352510018512.0Zn2+0100200221001.00962204698.83.0060181210367284.65.0045252010559578.87.00193627188114445.810.0094239199117718.9Pb2+0100100111000.2586842142292.50.50711595294890.61.005823118426980.22.00243627137612958.64.00104233159015323.0As3+0100000001000.05791452213093.80.104631194548176.50.203439225669872.20.40134532108713966.80.6064934119415031.0Cr3+0100000001000.10972103498.60.509342171197.81.006916123314985.6

5.005128165497580.610.0024422397611540.0Cd2+0100100111000.05963104598.60.109351171096.60.5089821111596.41.004436146568242.62.0032421796810335.2Hg2+0100000001000.05821251182593.40.10801361202892.50.20701596305190.60.30224028107812673.50.50163632168414851.01.4、DNA的損傷程度和DNA損傷區(qū)（任意單位）為了評(píng)估所有類型細(xì)胞的DNA損傷水平，根據(jù)細(xì)胞尾部的DNA占細(xì)胞總DNA含量的比例（Andersonetal.,1994），DNA損傷大致分級(jí)為＜5%（無(wú)損傷），5%—20%（低度損傷），21%—40%（中度損傷），41%—100%（高度損傷）。圖1呈現(xiàn)出不同程度的DNA損傷：無(wú)損傷（圖.1d）和低度、中度、高度損傷（依次是圖.1a-c）。圖1.重金屬處理后的典型的有效微生物的DNA細(xì)胞。（a）DNA的高度損傷；（b）DNA的中度損傷；（c）DNA的低度損傷；（d）空白試驗(yàn)。1.5、彗星實(shí)驗(yàn)根據(jù)Tice等人的方案（2000）進(jìn)行了堿性彗星實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)以上準(zhǔn)備和培養(yǎng)，1ml的培養(yǎng)液中混合70微升的0.7%低熔點(diǎn)（LMP）的瓊脂糖于37°C溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS）。彗星凝膠是通過(guò)取100微升0.7%普通熔點(diǎn)（NMP）的瓊脂糖鋪于一個(gè)冰凍載玻片上，并在上面蓋上一個(gè)22平方毫米的蓋玻片。凝膠凝固后，細(xì)胞核于4°C在強(qiáng)鹽性溶液中浸泡8h。該溶液是由2.5mol/L的NaCl,10mmol/L的三氨基甲烷鹽酸緩沖液（Tris）,100mmol/L的EDTA組成，調(diào)其pH值為10,然后再加入新鮮的10%的二甲亞颯和1%的TritonX-100。載玻片于室溫下在新鮮的電泳緩沖溶液（0.3mol/L的NaOH,5mmol/L的EDTA,pH值13）中培養(yǎng)30min，讓DNA解鏈。將載玻片水平放入電泳槽中，在具有相同的堿性冰溶液中，18mV電壓，200mA電流下電泳30min以輔助解鏈，載玻片用新鮮的中性緩沖溶液（0.4mol/L的Tris，并用濃鹽酸調(diào)pH值到7.5）清洗兩次。在熒光顯微鏡下觀察彗星細(xì)胞經(jīng)15應(yīng)的5pg/mL的漠乙錠（EB）水溶液染色后DNA的損傷。每次處理后整個(gè)過(guò)程重復(fù)3次，并進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行比較。2結(jié)果與討論2.1、 有效微生物細(xì)胞DNA損傷水平與有效微生物污水處理能力的相關(guān)性對(duì)有效微生物而言，細(xì)胞中DNA組成的損壞似乎是主要的機(jī)制，當(dāng)重金屬存在時(shí)，有效微生物降低了生物降解廢水的能力（GindinerandHickoon,2000）。表1表明了可存活的有效微生物細(xì)胞數(shù)目的變化。圖2說(shuō)明了不同重金屬對(duì)于廢水處理效果的影響。這表明，有效微生物影響了廢水處理的效率。我們發(fā)現(xiàn)有效微生物細(xì)胞DNA損傷水平與有效微生物污水處理能力呈負(fù)相關(guān)性。事實(shí)上，當(dāng)Cu2+，Zn2+，Pb2+，As3+，Cr3+，Cd2+和Hg2+的濃度分別為10，10，4，0.6,10，2和0.5mg/L時(shí)，相應(yīng)的有效微生物細(xì)胞DNA受損細(xì)胞的百分比分別為100%,91%,90%,94%,76%,68%和84%（表1）。同時(shí)，有效微生物污水處理能力分別降低為12%,18.92%,23.1%,31.2%,40.1%,35.2%和51.2%。2.2、 有效微生物細(xì)胞存活數(shù)與有效微生物污水處理能力的相關(guān)性污染物同樣能夠影響群落結(jié)構(gòu)。在廢水中，重金屬能夠與酶產(chǎn)生化學(xué)合，例如DNA聚合酶，其能導(dǎo)致酶活性的降低（Cobbertt,2002;Tsuietal,2002;SunandZhou,2003）。此外，可存活有效微生物細(xì)胞的數(shù)目與有效微生物廢水處理能力（廢水中的COD去除率）呈正相關(guān)性。事實(shí)上，當(dāng)Cu2+,Zn2+,Pb2+,As3+,Cr3+,Cd2+和Hg2+的濃度都為0時(shí)，有效微生物細(xì)胞的可存活性百分?jǐn)?shù)都為100%,并且有效微生物廢水處理能力（廢水中的COQ,去除率）保持在原有的百分?jǐn)?shù)，分別為60%,65%,50%,63.2%,60%,60%和80%（圖2）。然而，當(dāng)Cu2+,Zn2+,Pb2+,As3+,Cr3+,Cd2+和Hg2+的濃度分別為10mg/L,10mg/L,4mg/L,0.6mg/L,10mg/L,2mg/L和0.5mg/L時(shí)，有效微生物細(xì)胞的可存活性百分?jǐn)?shù)降低為12%,18.9%,23%,31%,40%,35.2%,和51%（表1）。有效微生物廢水處理能力（廢水中的COD去除率）分別降低為12%,18.92%,23.1%,31.2%,40.1%,35.2%和51.2%(圖2)。fl2。4.06.0WIO.flflfl2。4.06.0WIO.flfl040.S1.11.62.fl00.100.2000.400.50C「*!cgnccntnajkin(mg.-1!.)Cd2'C^ncentraliiDn.(mgirl.| H甘1wnpcnlrMi^n(mg-'Ll圖2。重金屬對(duì)有效微生物去除污水CODcr的影響2.3、重金屬濃度與有效微生物細(xì)胞DNA損傷的相關(guān)性微生物對(duì)所處的環(huán)境很敏感（Vigetal，2003）。由于重金屬減少了降解效率，因此可能對(duì)某些物種有毒。其他的有毒劑包括紫外線，電離輻射和遺傳毒物。除了對(duì)DNA的直接損壞，可能還對(duì)它的修復(fù)機(jī)制存在危害，例如，切斷交聯(lián)，加合物和DNA蛋白質(zhì)加合物（Liuetal.,2004;Brienetal.,2002;Vasantetal.2001;Bagchietal.,2003;Boseetal.,1999）.。對(duì)有效微生物而言，細(xì)胞中DNA組成的損壞似乎是主要的機(jī)制，當(dāng)重金屬存在時(shí)，有效微生物降低了生物降解廢水的能力（GindinerandHickoon,2000）。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重金屬濃度越高時(shí)，有效微生物細(xì)胞的DNA損傷就越嚴(yán)重。舉例而言，當(dāng)Cu2+，Zn2+，Pb2+，As3+，Cr3+，Cd2+和Hg2+的濃度都為0mg/L時(shí)，有效微生物DNA損傷的任意單位分別為1，2,1，0，0，1和0。然而，當(dāng)Cu2+，Zn2+，Pb2+，As3+，Cr3+，Cd2+和Hg2+在廢水中的濃度分別達(dá)到了10mg/L，10mg/L，4mg/L，0.6mg/L，10mg/L，2mg/L和0.5mg/L時(shí)，觀察到，有效微生物DNA損傷的任意單位分別為185，177，153，150，115，103和148（表1）。同時(shí)，DNA的低度損傷、中度損傷和高度損傷的數(shù)目也在增加（表1）。不幸的是，由于我們得到的數(shù)據(jù)不足以推斷它們的命令，因此我們還不能指出這些參數(shù)間的特殊關(guān)系。因此，未來(lái)的深入和詳細(xì)的研究是必要的。與此同時(shí)，我們能夠從表2中看出，有效微生物對(duì)Cu2+，Zn2+，Pb2+，As3+，Cr3+，Cd2+和Hg2+的耐受濃度分別為0.05mg/L，10mg/L，1.0mg/L，0.05mg/L，0.50mg/L，2mg/L和0.10mg/L。這表明，當(dāng)重金屬濃度達(dá)到了這個(gè)確切值時(shí)，有效微生物污水處理能力就會(huì)迅速下降。也許，重金屬的獨(dú)特性就在于它的結(jié)合有效微生物細(xì)胞酶或蛋白質(zhì)的能力。目前，有效微生物技術(shù)被認(rèn)為是處理廢水最有效的方法。然而，如果重金屬的濃度，例如Cu2+,Zn2+,Pb2+,Av3+,Cr3+,Cd2+和Hg2+，在廢水中達(dá)到了有效微生物的容忍濃度，那么其對(duì)于廢水的處理效果將會(huì)降低。這項(xiàng)研究表明，當(dāng)在廢水中檢測(cè)到重金屬時(shí)，其能夠通過(guò)預(yù)處理過(guò)程移除。這一步能夠提高有效微生物廢水處理的效率。另一方面，有效微生物可以通過(guò)化學(xué)和物理過(guò)程來(lái)誘導(dǎo)重金屬，以此來(lái)抵抗重金屬。3結(jié)論本研究表明，有效微生物細(xì)胞DNA的損傷程度與有效微生物處理污水的能力呈負(fù)相關(guān)性。在另一方面，有效微生物的存活數(shù)與它處理污水的能力呈正相關(guān)性。在我們的結(jié)果中，有效微生物細(xì)胞DNA的損傷隨著重金屬的濃度的增加而逐漸加深。同時(shí)，這項(xiàng)研究表明有效微生物DNA會(huì)受到重金屬的影響。具體而言，重金屬中Av3+具有最大的危害，Hg2+緊跟其后。有效微生物對(duì)Av3+和Hg2+最大忍受的濃度分別為0.05mg/L和0.20mg/L。在另一方面，它能承受重金屬離子Cd2+、Cr3+和Cu2+的最大濃度都為0.5mg/L,然而對(duì)Pb2+和Zn2+的最大承受濃度為1mg/L。謝辭這項(xiàng)研究是在中國(guó)高科技發(fā)展計(jì)劃、中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金會(huì)和中國(guó)教育廣西省科研項(xiàng)目部的支持下完成的。作者對(duì)ElwoodPowell(ElwoodPowell,美國(guó)人，現(xiàn)在在中國(guó)華南理工大學(xué))對(duì)手稿的批閱和JamesIrish的幫忙編輯表示感謝。參考文獻(xiàn)AndersonD,YuTW,PhillipsBJ,SchmezerP,1994.Theeffectofvariousantioxidantsandothermodifyingagentsonoxygenradical-generatedDNAdamageinhumanlymphocytesintheCOMETassay.MutatRes,307:261-271.BagchiD,StohsSJ,DownsBW,BagchiM,PreussHG,2003.Cytotoxicityandoxidativemechanismsofdifferentformsofchromium.Toxicol,186(12):171-173.BoseRN,MoghaddasS,MazzerPA,1999.OxidativedamageofDNAbychromium(V)complexes:relativeimportanceofbaseversussugaroxidation.NucleicAcidsRes,27(10):2219-2226.BarradoE,PrietoF,LozanoB,2001.RemovalofH2Sbymetalferritesproducedinthepurificationofmetal-bearingwastewater:Studyofthereactionmechanism.Water,AirandSoilPollution,131:367-381.[5]BrienTO’，MandelHG,PritchardDE,2002.Criticalroleofchromium(Cr)-DNAinteractionsintheformationofCrinducedpolymerasearrestinglesions.Biochem,41:12529-12537.CobberttCS,2002.Phytochelatinbiosynthesisandfunctioninheavymetaldetoxification.PlantBiology,3:211-216.ChelliahER,KolandaswamyA,GovindanSS,2006.Isolationandcharacterizationofametal-resistantPseudomonasaeruginosastrain.WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,22:577-585.DongKY,ChenJM,1982.Theeffectofcadmiumoncropsgrowthandtherelationshipswiththecadmiumuptakeandaccumulation.EnvironmentalScience,3(4):31-33.ErokhinNF,KompanietsVI,LeonovYV,2006.Theuseofanultrasonicinterferometerformeasurementsinthecriticalregionoflightandheavywater.MeasurementTechniques,49:1160-1168.GindinerB,HickoonID,2000.DNAdamageandmechanismofrepair.CellTransmissions,18:3-10.KumaravelTS,AwadheshNJ,2006.ReliableCOMETassaymeasurementsfordetectingDNAdamageinducedbyionisingradiationandchemicals.MutationResearch,605:7-16.KowKLL,PoWK,JudyKYW,KingMG,1998.MetaltoxicityandmetallothioncingeneexpressionstudiesincommonCarpandTilapia.MarineEnvironmentalResearch,46(1):563-566.LiuW,YangYS,LiP,ZhouQ,SunT,2004.RootgrowthinhibitionandinductionofDNAdamageinsoybean(Glycinemax)bychlorobenzenesincontaminatedsoil.Chemosphere,57:101-106.MaHM,2002.LawofvarietyandstraitsofthepollutantsintheLanzhoustrainoftheYellowRiver.GansuEnvironmentalStudyandMonitoring,15(2):101-103.S'anchezEJ,L'opezPE,SantofimiaPE,2006.Theremovalofdissolvedmetalsbyhydroxysulphateprecipitatesduringoxidationandneutralizationofacidminewaters,IberianPyriteBelt.AquaticGeochemestry,12:269-298.SinghNP,McCoyMT,TiceRR,1988.AsimpletechniqueforthequantitationoflowlevelsofDNAdamageinindividualcells.ExpCellRes,175:184-191.SEPAC(StateEnvironmentalProtectionAdministrationofChina),2000.Analyticalmethodofthewaterandwastewater.Beijing:ChinaEnvironmentalSciencePress.211-213.SunDW,ZhanY,XuZR,2003.Studyonthehazardsofheavymetalstofishes.ReservoirFisheries,23(2):4-6.SunB,ZhouSL,2003.Combinedpollutionofheavymetalinsoilbasedonspatialvariationanlysis.JournalofAgro-EnvironmentScience,22(2):248-251.SofiaIAP,AnaIGL,EtelvinaMAPF,2006.ScreeningpossiblemechanismsmediatingcadmiumresistanceinRhizobiumleguminosarumbv.viciaeisolatedfromcontaminatedPortuguesesoils.MicrobialEcology,52:176-186.TeruoH,JamesFP,1994.BeneficialandEffectiveMicroorganismsforaSustain