蚯蚓蛋白水解工藝研究

蚯蚓蛋白水解工藝研究

蠕蟲(chóng)屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)的細(xì)胞菌素類(lèi)，是一種低無(wú)脊椎動(dòng)物的環(huán)節(jié)動(dòng)物。這是一個(gè)多功能的資源。不僅可以肥沃的土壤，而且可以凈化環(huán)境，提供動(dòng)物所需的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物和其他養(yǎng)分，以及溶縮酶、過(guò)氧化氫酶、腫瘤成分和溶血素等生物活性成分。作為重要的腐食食物鏈的土壤動(dòng)物,蚯蚓在農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物處理具有重要意義,并在孫振鈞,胡鋒,卓少明等努力下已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從理論到實(shí)際運(yùn)用的突破。但如何提高產(chǎn)物蚯蚓的經(jīng)濟(jì)效益將其資源化利用已成為急需要解決的問(wèn)題。蚯蚓蛋白制作成的氨基酸原料有廣泛的用途。蚯蚓消化道有10多種蛋白水解酶,如蚯蚓纖溶酶等,這些蛋白酶類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的水解活性,可使蛋白質(zhì)發(fā)生水解。因此,利用蚯蚓自身水解酶酶解蚯蚓蛋白質(zhì),是獲取較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值蚯蚓水解液最有效的方法之一。利用酶解工藝將蚯蚓蛋白制作成氨基酸原料,可用于復(fù)合蚯蚓營(yíng)養(yǎng)保健液、氨基酸葉面肥、氨基酸農(nóng)藥以及飼料添加劑的生產(chǎn)。當(dāng)前酶的應(yīng)用研究發(fā)展迅速,但是關(guān)于外源酸性蛋白酶對(duì)于蚯蚓蛋白酶解的影響研究報(bào)道不多。筆者探討了三種外源酶對(duì)蚯蚓粗蛋白下腳料水解的影響,研究了在加酶和不加酶的條件下鮮蚯蚓漿的氨基酸濃度的變化,并通過(guò)回歸分析建立了回歸方程模型,進(jìn)一步提高蚯蚓蛋白水解工藝提供參考。1材料和方法1.1試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)室內(nèi)試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤生化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.2蛋白下腳料供試蚯蚓,赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafetida),水分含量83%,蛋白質(zhì)含量35%,由德州大齊牧業(yè)有限公司提供蚯蚓粗蛋白下腳料,蛋白質(zhì)含量16%,含水量≤10%,pH≈6德州大齊牧業(yè)有限公司提供。外源蛋白酶,537酸性蛋白酶(30000U/g),1398中性蛋白酶(30000U/g),堿性蛋白酶(100000U/g)購(gòu)于北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司,冰箱4℃保存。1.3測(cè)試方法1.3.1外源蛋白酶的影響蚯蚓漿的制備:將蚯蚓放于鋪有一層已浸濕的濾紙的20cm×30cm×40cm塑料盤(pán)中,在其上部覆蓋干燥的濾紙,單層紗布封口,放于30℃恒溫箱中黑暗脫糞培養(yǎng)24h,取出蚯蚓,洗凈,電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿后,待用。外源蛋白酶對(duì)蚯蚓粗蛋白下腳料的作用:取等質(zhì)量的蚯蚓粗蛋白下腳料,按酶活力10000U/g加入中性蛋白酶、酸性蛋白酶與堿性蛋白酶酶解5h,未加外源蛋白酶的樣品為對(duì)照,底物濃度1:2,pH7.0,溫度50℃。不同水解時(shí)間比較:取勻漿放置半小時(shí)后蚯蚓漿50ml,加入537酸性蛋白酶900U/g,不加酶為對(duì)照,在pH7.0、底物濃度1:2、溫度25℃下放置1h,然后置于溫度50℃下水解,時(shí)間為2,3,4,6,8h,不加酶的處理水解時(shí)間為1,3,5,7,8h。1.3.2氨基態(tài)氮、全氮的測(cè)定水解反應(yīng)結(jié)束后,水解液100℃沸水浴加熱滅活10min,經(jīng)低速(3500rpm)、低溫(4℃)離心10min,取上清液分裝、密封,測(cè)定其水解率,氨基態(tài)氮含量。氨基態(tài)氮采用雙指示劑滴定法,全氮采用凱式定氮法。水解度%(DH)=(上清夜中氨基態(tài)氮含量/原料全氮含量)×100%1.3.3統(tǒng)計(jì)分析2結(jié)果與分析2.1酸性蛋白酶水解率高蚯蚓粗蛋白下腳料是混有蚯蚓糞的蚯蚓殘?bào)w,在蚯蚓養(yǎng)殖中一般作為下腳料與蚯蚓糞一起作為有機(jī)肥處理。在pH7.0,溫度50℃下酶解5h,采用雙指示劑滴定法氨基態(tài)氮,測(cè)定了三種蛋白酶對(duì)蚯蚓粗蛋白水解的影響,結(jié)果列于表1。表1的結(jié)果表明加入的三種蛋白酶都能提高水解速率。水解液的氨基態(tài)氮含量表示水解液中的實(shí)際氨基態(tài)氮數(shù)量,含量越高,水解液的利用價(jià)值越大。水解度則表示已經(jīng)水解的蛋白占原料中總蛋白數(shù)量的%,水解度越高說(shuō)明原料中蛋白水解越徹底,該水解工藝的應(yīng)用潛力越大。蚯蚓粗蛋白中蛋白含量只有16%左右,而雜質(zhì)含量高。在不加外源酶只依靠自身酶水解的情況下,氨基態(tài)氮含量只有0.084%,蛋白水解度3.19%,酶解效率很低,基本沒(méi)有利用價(jià)值,只能作為廢棄物處理。加入蛋白酶后,水解液的氨基態(tài)氮含量與水解度都明顯提高。中性蛋白酶處理的水解度提高到對(duì)照處理的2.57倍,堿性蛋白酶處理的水解度提高到對(duì)照處理的3.40倍,酸性蛋白酶效果最好,水解液中氨基態(tài)氮含量高達(dá)1.571%,水解度高達(dá)59.94%,是對(duì)照的18.79倍。這與原材料蚯蚓蛋白下腳料自身酸性有一定關(guān)系,酸性蛋白酶的適宜的pH在4.5~5.5,蚯蚓粗蛋白的pH是5.0,處于酸性蛋白酶的適宜pH范圍內(nèi),所以效率比較高。酸性蛋白酶的水解率與空白處理比較,差異極顯著,提高效果最明顯。極有利用研究?jī)r(jià)值,為蚯蚓粗蛋白下腳料的利用提供了新途徑。2.2酸性酶對(duì)甘蔗水的分解影響2.2.1加酶處理對(duì)鮮關(guān)于說(shuō)的影響蚯蚓體內(nèi)富含各種蛋白質(zhì),其總量達(dá)35%。蚯蚓蛋白自溶酶主要是胞內(nèi)酶,存在于蚯蚓自身腸道中。圖1中的無(wú)酶處理曲線既是蚯蚓蛋白靠自溶酶的水解結(jié)果?？梢钥闯鰺o(wú)酶處理的蚯蚓蛋白水解液氨基酸濃度隨著水解過(guò)程的進(jìn)行在提高,水解時(shí)間段中出現(xiàn)兩個(gè)顯著提升點(diǎn),既水解3h和水解7h,1h到3h內(nèi)氨基態(tài)氮變化不顯著,水解5h到7h內(nèi)氨基態(tài)氮變化不顯著。氨基態(tài)氮濃度在水解3h,5h,8h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異極顯著(p≤0.01),水解1h到8h氨基態(tài)氮濃度上升2.6倍。該研究將酸性蛋白酶加入到鮮蚯蚓漿中,觀察加酶后水解過(guò)程中氨基酸濃度的變化規(guī)律(圖1)。結(jié)果表明:與對(duì)照相同,加酶處理的氨基酸濃度也隨著水解過(guò)程的進(jìn)行在提高;但是整個(gè)水解過(guò)程中加酶處理的氨基酸濃度都明顯高于不加酶處理。說(shuō)明加酶處理顯著提高了蚯蚓漿中氨基酸濃度。圖1中2條曲線基本處于平行狀態(tài),說(shuō)明水解液中的氨基酸濃度增加速度相差不多。表2分析了酸性蛋白酶對(duì)蚯蚓漿蛋白水解度的影響?？梢钥闯?加酶處理對(duì)蚯蚓漿水解度的提高有顯著效果。方差分析表明,加酶處理與無(wú)酶對(duì)照相比在3h和8h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)水解率差異均達(dá)到顯著水平。在3h時(shí),加酶處理的水解度達(dá)到12.7%,而對(duì)照處理僅6.62%,水解度提高了91.8%。水解提高率隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,下降趨勢(shì)呈線性負(fù)關(guān)系,水解提高率與時(shí)間的相關(guān)系數(shù)為0.8。在8h時(shí),加酶處理水解度由12.7%提高到22%,不加酶處理水解度由6.62%提高到16.05%,水解度提高率只有37.1%。可能是酸性蛋白酶在酶解過(guò)程中其活性下降,造成水解提高率的下降。2.2.2加酶處理驗(yàn)證將水解時(shí)間和氨基酸濃度進(jìn)行一元非線性回歸分析,時(shí)間設(shè)為自變量X,氨基酸濃度設(shè)為應(yīng)變量Y,以顯著水平p≤0.05為基本篩選因子,相關(guān)系數(shù)R為優(yōu)化因子,最終選取了回歸擬合方程為指數(shù)方程(圖2),顯著檢驗(yàn)如表3。方差分析(表3)表明,兩個(gè)方程均符合擬合要求,無(wú)酶的回歸擬合方程達(dá)到顯著水平,加酶的擬合方程達(dá)到極顯著水平,這說(shuō)明加酶處理更適合指數(shù)方程。無(wú)酶處理和加酶處理模型的相關(guān)系數(shù)R分別為0.9383,0.9928,說(shuō)明模型和實(shí)際數(shù)據(jù)的擬合程度較高,回歸模型選擇正確。應(yīng)用2個(gè)回歸擬合方程計(jì)算出不同水解時(shí)間時(shí)的加酶與不加酶條件下蚯蚓蛋白水解液的氨基酸濃度,與實(shí)測(cè)值比較(表4),可以看出加酶處理的誤差值基本落在5%內(nèi),說(shuō)明該模型可靠;無(wú)酶處理誤差均大于5%,并出現(xiàn)不規(guī)則的波動(dòng)性,說(shuō)明該指數(shù)回歸模型擬合的程度差與加酶處理的回歸模型,同時(shí)也說(shuō)明蚯蚓自溶的過(guò)程是一個(gè)不穩(wěn)定的反應(yīng)過(guò)程。3外源酶對(duì)酶解產(chǎn)物的影響中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院劉波,謝駿等利用Asl.398枯草中性蛋白酶酶解蚯蚓,研制新型氨基酸生化制劑,通過(guò)正交設(shè)計(jì),得到獲得小肽,氨基酸等物質(zhì)的最佳酶解條件,初步比較了利用蚯蚓內(nèi)溶酶和外源酶對(duì)酶解產(chǎn)物組成的影響,自溶酶解蚯蚓的最佳條件pH7.0、底物濃度1:2、溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間6h,在最佳酶解條件下水解液中的氨基氮數(shù)最大。該研究對(duì)蚯蚓自溶(未加酶處理)的最佳方應(yīng)時(shí)間根據(jù)水解回歸模型大于6h,這可能與鮮蚯蚓漿中蛋白酶系的活力和濃度有關(guān),蚯蚓蛋白自溶酶主要是胞內(nèi)酶,預(yù)處理的蚯蚓漿的放置環(huán)境溫度和放置時(shí)間直接影響到蚓體中蛋白酶系的釋放,該試驗(yàn)的蚯蚓漿在常溫(25℃)環(huán)境下放置了1h,而前人勻漿后直接水解,這也為下一步研究預(yù)處理過(guò)程中溫度和放置時(shí)間對(duì)蚯蚓自溶工藝的影響的研究提供了思路。4白酶處理對(duì)鮮關(guān)于親水性及其衍生物的影響4.1蚯蚓粗蛋白水解液加入外源蛋白酶后,其氨基態(tài)氮含量與水解度都明顯提高,增加了蚯蚓粗蛋白下腳料的利用價(jià)值。3種蛋白酶對(duì)水解度的提高順序?yàn)樗嵝缘鞍酌?gt;堿性蛋白酶>中性蛋白酶。中性蛋白酶處理的水解度提高到對(duì)照處理的2.57倍,堿性蛋白酶處理的水解度提高到對(duì)照處理的3.40倍,酸性蛋白酶效果最好,對(duì)水解度影響達(dá)到極顯著水平水解液中氨基態(tài)氮含量高達(dá)1.571%,水解度高達(dá)59.94%,是對(duì)照的18.79倍。4.3酸性蛋白酶對(duì)鮮蚯蚓漿蛋白水解過(guò)程影響明顯。與不加酶處理相比,加酶處理顯著提高整個(gè)水解過(guò)程中的氨基酸濃度。水解8h,不加酶處理內(nèi)氨基酸濃度0.9%,加酶處理氨基酸濃度1.239%,兩者差異顯著。水解提高率隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,下降趨勢(shì)呈線性關(guān)系,水解提高率與時(shí)間呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.8。數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL整理