核酸序列分析

第四章核酸序列分析核酸序列分析，亦稱核酸測序技術(shù)，簡稱測序。

1、基因?qū)用娴募膊〈_診；

2、發(fā)現(xiàn)潛在疾病的發(fā)病風(fēng)險；

3、對個體化用藥提供指導(dǎo)；

4、指導(dǎo)生育健康的下一代；一、測序的意義

人類基因組計劃（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式啟動，其主要目標(biāo)有：識別人類DNA中所有基因（超過10萬個）；測定組成人類DNA的30億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于2003年完成。人類基因組計劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項偉大的科學(xué)工程，它奠定了21世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價值。造福人類的HGP1949年,FrederickSanger開發(fā)了測定胰島素兩條肽鏈氨基末端序列的技術(shù),1953年測定了胰島素的氨基酸序列。1950年，Edman提出了蛋白質(zhì)的N端測序技術(shù),后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了蛋白質(zhì)自動測序技術(shù)。1965年，Sanger等發(fā)明了RNA的小片段序列測定法,并完成了大腸桿菌5SrRNA的120個核苷酸的測定。同一時期,Holley完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運tRNA的序列測定。蛋白質(zhì)和RNA的測序技術(shù)二、測序技術(shù)的建立1975年，Sanger和Coulson發(fā)明了“加減法”測定DNA序列。1977年，

Sanger在引入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了雙脫氧鏈終止法,使得DNA序列測定的效率和準(zhǔn)確性大大提高。1977年，Maxam和Gilbert報道了化學(xué)降解法測定DNA的序列。DNA測序技術(shù)的建立DNA序列測定技術(shù)出現(xiàn)后,迅速超越了蛋白質(zhì)和RNA測序技術(shù),成為現(xiàn)代分子生物學(xué)中最重要的技術(shù)。神奇的基因測序三、DNA測序技術(shù)的發(fā)展第一代DNA測序技術(shù)第二代DNA測序技術(shù)第三代DNA測序技術(shù)測序技術(shù)的發(fā)展雙脫氧末端終止法(Sanger測序法)1970s同位素標(biāo)記，手工1980s熒光標(biāo)記，自動1990s毛細(xì)管電泳合成測序法（第二代測序）焦磷酸測序（Pyrosequencing,Roche/454）合成測序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）連接測序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）單分子測序技術(shù)（第三代測序）HelicosPacificBiosciences9

1994：3億美元測定一個人類基因組(1:10)1984：30億美元測定一個人類基因組2004：3千萬美元測定一個人類基因組(1:100)2006：1百50萬美元測定一個人類基因組(1:2000)2008：50萬美元測定一個人類基因組(1:6000)未來目標(biāo)：1000/100美元測定一個人類基因組2011：5000美元測定一個人類基因組2014：上萬元測定一個人類基因組1、第一代DNA測序技術(shù)第一代DNA測序技術(shù)：傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種DNA測序技術(shù)。第一代DNA測序技術(shù)包括：雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法、熒光自動測序技術(shù)。鏈終止法利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測定DNA核苷酸順序的方法，是由英國劍橋分子生物學(xué)實驗室的生物化學(xué)家F.Sanger等人于1977年發(fā)明的。F.Sanger（1980年諾貝爾獎獲得者）（Thechainterminationmethod）與PCR反應(yīng)類似。反應(yīng)體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；反應(yīng)過程：變性－復(fù)性－延伸－終止Sanger雙脫氧鏈終止法利用DNA聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3’-末端。因為ddNTP3’不是-OH，不能與下一個核苷酸聚合延伸，從而終止DNA鏈的增長。雙脫氧鏈終止法基本原理：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長度只差一個核苷酸的DNA分子。雙脫氧鏈末端終止法測序原理示意圖

鏈終止技術(shù)路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

如果測序反應(yīng)產(chǎn)物被放射性標(biāo)記：

通過放射自顯影膠片上的帶型，可直接讀出DNA上的核苷酸順序。

如果產(chǎn)物被一種熒光染料標(biāo)記：

當(dāng)他們通過電泳膠道時被激光照射而激發(fā)熒光時可被探測裝置搜集，由此得到的信號生成與DNA序列相對應(yīng)的帶型或軌跡模式，從而實現(xiàn)DNA序列分析的自動化。凝膠電泳和序列讀取如果進(jìn)行自動化分析可以一次性讀取1000bp序列DNA自動分析技術(shù)的測序反應(yīng)體系主要包括：DNA模板

測序引物DNA聚合酶熒光標(biāo)記熒光染料及熒光標(biāo)記技術(shù)在DNA自動化測序中被廣泛應(yīng)用。DNA模板：

1.單鏈DNA模板2.雙鏈DNA模板3.PCR產(chǎn)物DNA聚合酶：

1.大腸桿菌DNA聚合酶1大片段2.測序酶3.耐熱DNA聚合酶熒光標(biāo)記方案：

1.染料標(biāo)記引物2.染料標(biāo)記終止物3.內(nèi)部標(biāo)記通過M13mp載體獲得單鏈DNA以測序M13mp噬菌體載體是專為得到單鏈DNA測序模板而設(shè)計的。Sanger法因操作簡便，得到廣泛的應(yīng)用。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動測序技術(shù)。熒光自動測序技術(shù)熒光自動測序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記，并用成像系統(tǒng)自動檢測，從而大大提高了DNA測序的速度和準(zhǔn)確性。目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自動測序儀即是基于毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)的DNA測序儀。

如ABI3730XL測序儀擁有96道毛細(xì)管，4種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標(biāo)記，在通過毛細(xì)管時不同長度的DNA片段上的4種熒光基團被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被CCD檢測系統(tǒng)識別，并直接翻譯成DNA序列。目前所用自動測序技術(shù)的改進(jìn)3730

全自動測序儀用不同的熒光色彩標(biāo)記ddNTP,如ddATP標(biāo)記紅色熒光,ddTTP標(biāo)記綠色熒光,ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光,ddGTP標(biāo)記黃色熒光,由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基.產(chǎn)物條帶經(jīng)過檢測儀時給出特定信號，由計算機判讀并記錄。第一代全自動測序

——毛細(xì)管電泳測序用毛細(xì)管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳，可使DNA的測序速度更為迅速。這種電泳裝置有96個泳道，每次可同時進(jìn)行96次測序，每輪實驗不到2小時，1天可完成近千次反應(yīng)。自動DNA測序儀的主要構(gòu)成：1.測序反應(yīng)系統(tǒng)2.電泳系統(tǒng)3.熒光檢測系統(tǒng)4.電腦分析系統(tǒng)

自動DNA測序儀的種類：

第一類采用“單染料/四泳道”第二類采用“四染料/單泳道”

測序策略

定義：測定未知DNA序列的方案，

即應(yīng)該通過具有最小重疊、最少數(shù)量的測序反應(yīng)，能拼接成目的DNA正確的序列。對于一個待測DNA分子，要制定一個能夠簡捷準(zhǔn)確的測定方案，應(yīng)考慮：1.DNA片段大小2.背景資料3.測序目的4.實驗條件測序策略確證性測序策略：對已知序列的次級克隆或PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和證實。未知DNA序列的測定策略對于較小的目的DNA片段（如小于1KB）,可以直接利用M13mp或質(zhì)粒系統(tǒng)克隆、測序。對于數(shù)千個堿基的大片段未知序列DNA，乃至數(shù)億個堿基的生物基因組，必須將其切割成適當(dāng)大小的各個片段（如小于1KB）分別進(jìn)行次級克隆再進(jìn)行測序，最后拼接全序列。2、第二代DNA測序技術(shù)新一代測序技術(shù)也稱第二代測序技術(shù)，使用接頭進(jìn)行高通量的并行PCR和并行測序反應(yīng)，并結(jié)合微流體技術(shù)，利用高性能的計算機對大規(guī)模的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和分析。

商品化的測序平臺主要有：羅氏/454公司的GSFLX測序平臺、Illumina公司的GenomeAnalyzer測序平臺ABI公司的SOL2iD測序平臺。基本原理：

先進(jìn)行文庫制備，即將片段化的基因組DNA兩側(cè)連上通用接頭；隨后運用PCR技術(shù)擴增技術(shù)來產(chǎn)生幾百萬個空間固定的DNA簇，這種DNA簇由單個文庫片段的多個拷貝組成，稱PCR克隆陳列或（稱聚合酶克?。?，最后進(jìn)行測序，即測定每個克隆的核苷酸序列。

這些反應(yīng)能大規(guī)模的同時進(jìn)行，然后對每一步反應(yīng)所產(chǎn)生的信號進(jìn)行同時檢測，以此來獲取測序的數(shù)據(jù)，經(jīng)過計算機分析獲得完整的DNA序列信息，能實現(xiàn)一次對幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定。工作流程：

文庫制備DNA簇的產(chǎn)生測序邊合成邊測序

焦磷酸測序技術(shù)

連接測序第二代測序技術(shù)不需要進(jìn)行DNA模板克隆。第二代測序技術(shù)最顯著的特征是高通量,一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測序,使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。第二代測序技術(shù)最大的優(yōu)勢在于其測序通量的持續(xù)增長，具有很大的發(fā)展?jié)摿Α５诙鷾y序技術(shù)并不完美，由于其在測序前要通過PCR手段對待測片段進(jìn)行擴增，因此增加了測序的錯誤率。并且其測序結(jié)果比較短，更適合重測序，而不太適用于沒有基因組序列的全新測序。第二代測序技術(shù)的應(yīng)用1.從頭測序、重測序和個體基因組測序2.個體基因組測序和SNP研究3.轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜分析4.小分子RNA研究3、第三代DNA測序技術(shù)

最近,以單分子DNA進(jìn)行非PCR的測序為主要特征的第三代DNA測序技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn),

如生物科學(xué)公司(BioScienceCorporation)的HeliScope單分子測序儀。第三代測序技術(shù)的目標(biāo)是：

實現(xiàn)人全基因組3分鐘的測序時間及5000美元的測序價格。高通量單分子測序原理第三代測序技術(shù)獲重大進(jìn)展基因測序亂象多思考題1.第一代DNA測序技術(shù)的核心技術(shù)A.Sanger的雙脫氧鏈終止法B.Maxam和Gilbert的化學(xué)降解法C.熒光標(biāo)記技術(shù)D.PCR技術(shù)E.DNA自動分析技術(shù)2.Sanger雙脫氧鏈終止法使用的鏈終止物A.NTPB.dNTPC.ddNTPD.a-32P-dNTPE.a-35S-dNTP3.不適宜于直接作為第一代測序技術(shù)測序的DNA模板A.雙鏈DNA片段和PCR產(chǎn)物B.單鏈DNA片段C.克隆于質(zhì)粒載體的DNA片段D.克隆于真核載體的DNA片段E.提取的染色質(zhì)DNA4.DNA自動化測序技術(shù)一般不用到的技術(shù)A.Sanger的雙脫氧鏈終止法

B.Maxam和Gilbert的化學(xué)降解法C.熒光標(biāo)記技術(shù)D.PCR技術(shù)E.電泳技術(shù)5.不是自動DNA測序儀的主要系統(tǒng)之一A.測序反應(yīng)系統(tǒng)B.電泳系統(tǒng)C.熒光檢測系統(tǒng)D.探針熒光標(biāo)記系統(tǒng)E.電腦分析系統(tǒng)6.要制定一個能夠簡捷準(zhǔn)確的DNA測定方案，一般應(yīng)考慮A.DNA片段的大小B.背景資料C.實驗條件D.測序目的E.以上都是7.第二代測序技術(shù)一般不用到A.雙脫氧鏈終止法B.文庫接頭C.高通量的并行PC