橡膠樹gr1基因的克隆及表達(dá)分析

橡膠樹gr1基因的克隆及表達(dá)分析

橡膠樹產(chǎn)于亞馬森河流域。作為一種重要的亞熱帶經(jīng)濟(jì)樹種，它是目前天然橡膠的唯一經(jīng)濟(jì)來源。硫醇類化合物廣泛存在于橡膠樹膠乳中,其主要成分為還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)。它在橡膠樹排膠和死皮發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,能提高黃色體及其他細(xì)胞器的穩(wěn)定性,防止膠乳原位凝固(Chrestin等1985),死皮橡膠樹最初表現(xiàn)為膠乳硫醇含量下降(?，F(xiàn)周1996)。谷胱甘肽還原酶(glutathionereductase,GR)(EC1.8.1.7)是一種廣泛存在于原核和真核生物中的黃素蛋白氧化還原酶。它利用NADPH作為唯一的還原力和電子供體,催化氧化型谷胱甘肽(oxidizedglutathione,GSSG)還原為還原型GSH。GR對維持胞內(nèi)高比率GSH/GSSG有重要作用。作為一種重要的抗氧化酶,GR通過抗壞血酸-谷胱甘肽(ascorbate-glutathione,AsA-GSH)循環(huán)參與清除植物體內(nèi)多余活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS),是還原型AsA和GSH再生過程中的關(guān)鍵酶。自1951年首次發(fā)現(xiàn)植物GR(Conn和Vennesland1951)以來,人們已對豌豆(Creissen等1991)、玉米(Mahan和Burke1987)、擬南芥(Kubo等1993)、水稻(Kaminaka等1998)、小麥(Lascano等2001)和煙草(Creissen和Mullineaus1995)等植物GR進(jìn)行了純化鑒定及基因克隆。研究發(fā)現(xiàn)70%~80%的GR定位在葉綠體,此外細(xì)胞質(zhì)、線粒體、過氧化物酶體和乙醛酸體中也有GR存在(Rao和Reddy等2008)。Rouhier等(2006)根據(jù)GR蛋白N-末端氨基酸序列特征將GR分為短胞質(zhì)亞型GR1和長細(xì)胞器亞型GR2。GR多以同源二聚體形式存在,但也有特殊情況,雷氏衣藻GR以單體形式存在(Takeda等1993),玉米和豌豆GR以異源二聚體形式存在(Mahan和Burke1987;Kalt-Torres等1984)。高等植物GR為一個小的基因家族,目前在擬南芥(Kubo等1993)、煙草(Creissen和Mullineaus1995)、豌豆(Creissen等1991;Stevens等1997)和豇豆(Contour-Ansel等2006)等物種中均發(fā)現(xiàn)2個GR,水稻和楊樹中均發(fā)現(xiàn)3個GR(Rouhier等2006;Wu等2013)。GR是一種受逆境脅迫調(diào)控表達(dá)的酶,在植物抵御氧化脅迫過程中發(fā)揮重要作用(Schaedle和Bassham1977)。干旱(Contour-Ansel等2006;Khanna-Chopra和Selote2007)、高鹽(Wu等2013;Hossain等2011)、低溫(Huang和Guo2005;Zhang等2013)、臭氧(Kubo等1995)、重金屬(Panda等2011)、除草劑(Romero-Puertas等2006)等逆境脅迫條件下GR活性或表達(dá)量明顯增加。本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)擴(kuò)增并克隆HbGR1全長cDNA;利用生物信息學(xué)軟件對該基因及其編碼氨基酸的性質(zhì)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測;采用real-timePCR技術(shù)研究該基因的表達(dá)模式。利用pEASY-E1/BL21(DE3)系統(tǒng)原核表達(dá)HbGR1蛋白。為進(jìn)一步研究HbGR1在橡膠樹中的功能提供理論依據(jù),同時還將促進(jìn)橡膠樹乳管細(xì)胞活性氧信號傳導(dǎo)研究的發(fā)展。材料和方法1膠乳和樹皮樣品的采集本研究所用樣品均采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗農(nóng)場。各組織樣品采自1990年定植的橡膠樹(HeveabrasiliensisMuell.Arg.)品系熱研7-33-97。以1997年定植的橡膠樹品系PR107為實驗樹,參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部(2006)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采集不同死皮(tappingpaneldryness,TPD)等級橡膠樹膠乳和樹皮樣品。選用2003年定植的未開割熱研7-33-97幼樹,參照Hao和Wu(2000)方法進(jìn)行乙烯利(ET)和茉莉酸甲酯(MeJA)處理,在處理0、4、8、24、48和72h后采集膠乳。參照Zhu等(2010)和Tang等(2010)方法分別進(jìn)行H2O2和傷害處理,采集處理后0、6、24和48h膠乳。以不作任何處理的未開割幼樹為對照。2實驗方法2.1清除含dna的dna參照Xu等(2010)方法提取總RNA。RNA中殘留的少量DNA用DNaseI去除。按照RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit說明書合成第一鏈cDNA。2.2race擴(kuò)增程序根據(jù)已知橡膠樹GR1的EST序列(GenBank登錄號:EU526129)設(shè)計一對特異引物GR1F和GR1R(表1),用健康橡膠樹膠乳cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為94℃5min;94℃30s,50℃30s,72℃30s,共30個循環(huán);72℃7min。PCR產(chǎn)物回收后連接至pMD18-T載體,挑取陽性克隆遞交公司測序。根據(jù)基因片段測序結(jié)果設(shè)計3′RACE引物GR1-3R-GSP和GR1-3R-NSP,5′RACE引物GR1-5R-GSP和GR1-5R-NSP(表1)。參照SMART?RACEcDNAAmplification試劑盒說明書進(jìn)行RACE擴(kuò)增。5′RACE兩輪擴(kuò)增程序均為94℃5min;94℃30s,60℃30s,72℃2min,共25個循環(huán);72℃7min。3′RACE第1輪擴(kuò)增程序為94℃5min;94℃30s,72℃2min,共5個循環(huán);94℃30s,70℃30s,72℃2min,共5個循環(huán);94℃30s,68℃30s,72℃2min,共25個循環(huán);72℃7min。3′RACE第2輪擴(kuò)增程序同5′RACE擴(kuò)增程序。PCR產(chǎn)物回收后連接至pMD18-T載體,挑取陽性克隆遞交公司測序。根據(jù)橡膠樹GR1的拼接結(jié)果設(shè)計引物HbGR1F和HbGR1R(表1),用PyrobestTMDNA酶擴(kuò)增全長序列。擴(kuò)增程序為94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃2min,共30個循環(huán);72℃7min。PCR產(chǎn)物回收后連接至pMD18-T載體,挑取陽性克隆遞交公司測序。2.3相對表達(dá)量的計算采用real-timePCR對HbGR1的表達(dá)模式進(jìn)行分析。根據(jù)HbGR1全長序列設(shè)計特異引物HbGR1-RTF和HbGR1-RTR(表1),以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增程序為94℃30s;94℃5s,60℃20s,72℃20s,共45個循環(huán)。以橡膠樹18SrRNA基因為內(nèi)參,設(shè)計引物Hb18SF和Hb18SR(表1)。用2-(35)(35)CT法計算相對表達(dá)量。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2.4質(zhì)粒提取和分離根據(jù)HbGR1序列設(shè)計引物HbGR1-ORFF和HbGR1-ORFR用于擴(kuò)增開放閱讀框(表1)。以橡膠樹膠乳cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序為94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃2min,共30個循環(huán);72℃10min。將回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pEASY-E1載體,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑取陽性克隆遞交公司測序。將測序正確的陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆接種到LB液體培養(yǎng)基(含100μg·mL-1Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜。將菌液按1%比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB液體培養(yǎng)基(含100μg·mL-1Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.4左右,加入IPTG至終濃度1mmol·L-1,誘導(dǎo)表達(dá)4h后離心收集菌體,用0.1mol·L-1TrisHCl(pH8.0)緩沖液將菌體沉淀洗滌2次,重懸菌體,加入2×上樣緩沖液,水浴煮沸10min,12000×g離心5min,取適量上清用12%的SDS分離蛋白。以空載體及未誘導(dǎo)的重組表達(dá)載體作為對照。結(jié)果1植物界hbgr1將EST序列和RACE測序結(jié)果進(jìn)行拼接,獲得橡膠樹GR1基因全長cDNA序列。用引物對全長序列進(jìn)行PCR驗證,測序結(jié)果顯示拼接序列正確,該序列長度為2082bp,含有一個1491bp的開放閱讀框,編碼496個氨基酸,5′端非翻譯區(qū)為293bp,3′端非翻譯區(qū)為298bp,含有典型的真核生物加尾信號AATAAA和poly(A)尾。序列分析表明HbGR1不具有信號肽,定位于細(xì)胞質(zhì),202~276位氨基酸序列為NADH結(jié)合結(jié)構(gòu)域,370~480位氨基酸序列為二聚體結(jié)構(gòu)域,67~83位氨基酸序列為高度保守基序。BLAST比對結(jié)果顯示,該基因翻譯的氨基酸序列與葡萄、梅花、川桑、可可、蘋果、毛果楊和蓖麻等植物胞質(zhì)型GR氨基酸序列一致性達(dá)85%~90%(圖1)。據(jù)此,將該基因命名為HbGR1(GenBank登錄號:GU952813)。HbGR1蛋白預(yù)測分子量為53.68kDa,等電點為6.18。采用MEGA-6.06軟件構(gòu)建植物胞質(zhì)型GR系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果顯示,單子葉植物水稻和玉米聚為一支,而雙子葉植物葡萄、梅花、川桑、可可、蘋果、毛果楊、蓖麻、橡膠樹和擬南芥等聚為另一支。HbGR1屬于雙子葉植物亞類,與同屬大戟科的蓖麻親緣關(guān)系最近。2hbgr1在組織中的表達(dá)以Hb18SrRNA為內(nèi)參,利用real-timePCR分析HbGR1表達(dá)模式。組織表達(dá)結(jié)果顯示,HbGR1在花、樹皮、葉片和膠乳中均表達(dá),其中膠乳中表達(dá)量最高、葉片中表達(dá)量最低(圖3)。與健康樹相比,除3級死皮樹膠乳中HbGR1表達(dá)升高外,隨著死皮的進(jìn)程膠乳中HbGR1表達(dá)逐漸下降;與健康橡膠樹相比,2級死皮樹樹皮中HbGR1表達(dá)量明顯升高,其余等級死皮樹樹皮中HbGR1表達(dá)量均下降,并低于健康樹(圖4)。分析ET、MeJA、傷害和H2O2等處理條件下HbGR1的表達(dá)模式,結(jié)果顯示HbGR1表達(dá)受上述4種處理所調(diào)控。其中ET處理4h后HbGR1表達(dá)明顯下調(diào),8h表達(dá)量最低,隨后逐漸上調(diào),至72h時表達(dá)量最高。MeJA處理后HbGR1的表達(dá)出現(xiàn)波動,處理4h后表達(dá)量顯著下調(diào),隨后逐漸上調(diào),至48h時表達(dá)量最高,但72h表達(dá)量再次下調(diào)(圖5-A)。H2O2處理后HbGR1表達(dá)量逐漸升高,48h表達(dá)量達(dá)到最高。傷害處理后6h表達(dá)量明顯增加,隨后逐漸降低(圖5-B)。以上研究結(jié)果表明HbGR1可能參與橡膠樹死皮過程,并在抵御乙烯、JA、傷害和H2O2等處理引起的氧化脅迫過程中發(fā)揮重要作用。3原核表達(dá)載體的構(gòu)建以橡膠樹膠乳cDNA為模板,擴(kuò)增出一條1500bp左右的目的條帶,回收該條帶,與pEASY-E1載體連接后挑取陽性克隆測序。重組質(zhì)粒的測序結(jié)果與HbGR1開放閱讀框序列完全一致,表明原核表達(dá)載體pEASY-E1-HbGR1構(gòu)建成功。把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3),挑取單克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基(含100μg·mL-1Amp)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS分析。電泳結(jié)果顯示,與對照菌株相比,pEASY-E1-HbGR1重組菌中多出了1條約55kDa左右的蛋白條帶,與預(yù)計表達(dá)的pEASY-E1-HbGR1融合蛋白大小相符(圖6),說明HbGR1在大腸桿菌中成功表達(dá)。不同死皮不同等級橡膠樹膠乳ros活性的變化割膠后排膠持續(xù)時間是決定橡膠樹產(chǎn)量的主要因子之一,而橡膠樹死皮是限制橡膠樹產(chǎn)量提高的主要因素。橡膠樹乳管內(nèi)黃色體的穩(wěn)定性與割膠后排膠時間和死皮密切相關(guān)。Chrestin等(1985)認(rèn)為硫醇是黃色體的穩(wěn)定劑,硫醇能清除ROS或催化ROS轉(zhuǎn)化為非毒性物質(zhì),阻止ROS破壞不飽和脂肪酸,從而保護(hù)黃色體及其他細(xì)胞器膜的完整性,防止膠乳原位凝固。目前生產(chǎn)中大規(guī)模使用促進(jìn)排膠的ET來刺激增產(chǎn),本研究發(fā)現(xiàn)HbGR1表達(dá)受ET調(diào)控,在ET處理8h之內(nèi),HbGR1的表達(dá)量呈下調(diào)趨勢,而8h后HbGR1的表達(dá)量逐漸上調(diào),至72h時達(dá)到最高。ET可誘導(dǎo)橡膠樹產(chǎn)生ROS,HbGR1可能通過再生GSH參與清除過量產(chǎn)生的ROS以保護(hù)黃色體膜,從而促進(jìn)橡膠樹乳管排膠。Chrestin(1989)認(rèn)為橡膠樹死皮是由于ROS產(chǎn)生與清除之間失衡而引起黃色體破裂所致。Venkatachalam等(2007)和Li等(2010)認(rèn)為ROS在橡膠樹死皮發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。死皮橡膠樹乳管中ROS的非酶促解毒功能和代謝活性降低,膠乳硫醇含量明顯下降,這說明膠乳硫醇含量和死皮發(fā)生過程密切相關(guān)。Li等(2010)和鄧治等(2012)分別從基因和蛋白水平發(fā)現(xiàn)健康樹膠乳中GR基因表達(dá)量和酶活性高于死皮樹,但未對死皮不同等級中GR表達(dá)量變化進(jìn)行詳細(xì)研究。本文從基因水平研究HbGR1與橡膠樹死皮進(jìn)程間的關(guān)系,取不同死皮等級橡膠樹膠乳和樹皮為材料研究HbGR1表達(dá)模式。研究結(jié)果表明,隨著死皮的進(jìn)程,HbGR1表達(dá)量除在3級死皮樹膠乳中出現(xiàn)明顯升高外,其余死皮等級橡膠樹膠乳中HbGR1表達(dá)量總體上呈逐漸下降趨勢。隨著死皮的進(jìn)程樹皮中HbGR1表達(dá)量除在2級死皮樹中明顯升高外,其他等級中均低于健康樹,且下降幅度變化不大。死皮樹膠乳中HbGR1表達(dá)量比樹皮中下降明顯。以上研究結(jié)果說明,在死皮的不同階段橡膠樹膠乳和樹皮中ROS清除能力可能出現(xiàn)波動,膠乳中GSH/GSSG比例對橡膠樹死皮造成的影響可能比樹皮更為明顯。MeJA處理橡膠樹4h后膠乳HbGR1表達(dá)量顯著下調(diào),隨后逐漸上調(diào),至48h時表達(dá)量最高,但72h表達(dá)量再次下調(diào)。傷害處理后6h表達(dá)量明顯增加,隨后逐漸降低。傷害能誘導(dǎo)內(nèi)源JA產(chǎn)生,JA是植物響應(yīng)傷害和環(huán)境脅迫的一個重要調(diào)節(jié)子,它與乙烯信號通路之間的交叉互作在植物抵