生物制品技術(shù)審評一般原則

0914欄目生物制品評價>>生物制品技術(shù)審評普通原則標(biāo)題重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細(xì)胞質(zhì)量控制技術(shù)評價普通原則作者審評五部部門正文內(nèi)容一、前言

對于構(gòu)造復(fù)雜、帶有糖基化修飾基團的抗體、凝血因子、酶、激素等生物大分子，普通需要借助哺乳動物細(xì)胞才干對的體現(xiàn)和修飾成與預(yù)期生物活性相似的重組制品。隨著生物工程技術(shù)的進步和發(fā)展，現(xiàn)在這些細(xì)胞應(yīng)用不停增多。

在宿主細(xì)胞選擇、重組工程細(xì)胞構(gòu)建以及生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)擴增和監(jiān)控過程中，不僅要關(guān)注細(xì)胞的合用性、目的產(chǎn)物體現(xiàn)生產(chǎn)能力，同時還應(yīng)當(dāng)重視隨著細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的內(nèi)源性病毒、宿主細(xì)胞殘存蛋白和DNA、致腫瘤成分等潛在的風(fēng)險性因素對重組產(chǎn)品帶來的安全性影響，在早期研究階段，同時開展庫細(xì)胞、生產(chǎn)培養(yǎng)過程細(xì)胞、生產(chǎn)終末細(xì)胞的全方面檢定和控制以及病毒和/或致瘤性成分的去除/滅活工藝的驗證。

（一）目的和意義

通過全方面檢測的種子細(xì)胞是實現(xiàn)重組基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)的前提和基礎(chǔ)，使生產(chǎn)用種子細(xì)胞含有共同的始祖細(xì)胞，保持相似的遺傳和生物學(xué)特性，在特定的培養(yǎng)環(huán)境和條件下持續(xù)穩(wěn)定體現(xiàn)攜帶的外源目的基因；通過研究擬定細(xì)胞在擴增培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中的變化，才干夠有效控制風(fēng)險性因素，滿足生產(chǎn)的持續(xù)需求，使產(chǎn)品質(zhì)量保持一致。

本技術(shù)評價普通原則重在敘述重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細(xì)胞質(zhì)量控制的基本內(nèi)容和有關(guān)規(guī)定，以期引導(dǎo)開展全方面完整的細(xì)胞質(zhì)量實驗研究、生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)工藝驗證，建立系統(tǒng)規(guī)范的重組工程細(xì)胞庫及實現(xiàn)生產(chǎn)過程細(xì)胞質(zhì)量的有效監(jiān)控。

（二）合用范疇

本技術(shù)評價普通原則合用于生產(chǎn)治療用重組制品的哺乳動物細(xì)胞，不涉及細(xì)菌、酵母等重組工程菌，也不涉及治療用體細(xì)胞、疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)、雜交瘤細(xì)胞等。有關(guān)內(nèi)容可參見國家局已頒布的指導(dǎo)原則和藥品審評中心公布的藥品技術(shù)評價普通原則，重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細(xì)胞亦須符合這些已有文獻的有關(guān)規(guī)定。

（三）局限性

本技術(shù)評價普通原則重要結(jié)合現(xiàn)在對于重組工程細(xì)胞構(gòu)造、功效，細(xì)胞致瘤性和內(nèi)源性病毒對重組產(chǎn)品帶來的風(fēng)險及微生物污染因子的危害性共識，提出技術(shù)審評關(guān)注的重點問題和基本原則，需要結(jié)合具體細(xì)胞和實際培養(yǎng)控制條件考慮和選擇。

二、宿主細(xì)胞的選擇

應(yīng)選擇來源、背景十分清晰的適宜宿主細(xì)胞，明確存在的內(nèi)源性病毒和/或致瘤性等影響制品安全性的因素，并結(jié)合制品純化的程度、細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中風(fēng)險性成分的去除/滅活能力及殘留量控制水平，以及臨床應(yīng)用適應(yīng)癥和使用方法用量等特點綜合分析，經(jīng)利弊權(quán)衡后擬定與特定制品相適應(yīng)的宿主細(xì)胞。應(yīng)首先選擇致瘤性實驗陰性和低增殖代次水平的宿主細(xì)胞。

對于全新構(gòu)建的轉(zhuǎn)化細(xì)胞、從未使用過的改良傳代細(xì)胞，甚至腫瘤細(xì)胞等，由于前期研究、背景資料和致瘤性風(fēng)險等積累的認(rèn)識十分有限，其開發(fā)應(yīng)用將引入新的安全性隱患，需要謹(jǐn)慎權(quán)衡利弊，在開展充足研究的基礎(chǔ)上嚴(yán)格控制潛在的風(fēng)險性。

（一）宿主細(xì)胞來源、傳代保存通過和普通特性

用于構(gòu)建重組工程細(xì)胞的宿主細(xì)胞其來源和傳代保存過程應(yīng)清晰，可溯源有關(guān)背景資料，例如最初分離建立株/系的機構(gòu)，在不同機構(gòu)內(nèi)引進和傳代通過，既往進行過的檢測分析項目和確證研究成果，細(xì)胞保存狀態(tài)，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)已達(dá)成的增殖代次/水平及傳代過程中所用過的人源或動物源性材料等。傳代保存過程中細(xì)胞應(yīng)保持原有特性，沒有發(fā)生變異和污染。優(yōu)先選用最初建立的細(xì)胞系或由其傳代保存的低代次細(xì)胞。

1、宿主細(xì)胞來源和傳代保存通過

應(yīng)提供宿主細(xì)胞來源的有關(guān)資料和證明性文獻，闡明與否曾進行過遺傳操作引入了外源基因序列，描述已進行過的研究檢定項目例如細(xì)胞鑒定、內(nèi)源和外源性因子檢測等的成果及引進時進行的復(fù)核檢定成果。

2、宿主細(xì)胞普通特性

需敘述宿主細(xì)胞的基本特性，如形態(tài)、培養(yǎng)和生長普通特性、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液規(guī)定。新構(gòu)建的細(xì)胞系應(yīng)檢測致瘤性特性。

三、重組工程細(xì)胞克隆構(gòu)建過程、篩選及鑒定

現(xiàn)在可采用多個體現(xiàn)載體、宿主細(xì)胞、基因?qū)朕k法和篩選標(biāo)記等進行工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選，構(gòu)建成功的標(biāo)志是工程細(xì)胞能夠穩(wěn)定、高效地體現(xiàn)構(gòu)造對的且含有生物活性的目的產(chǎn)物。應(yīng)盡量提供有關(guān)重組工程細(xì)胞構(gòu)建和鑒定的具體資料并重點描述：

（一）目的基因來源

應(yīng)涉及最初獲得目的基因序列的來源和背景方面的資料，用于制備目的基因cDNA的辦法，以及必要的初步序列分析。

（二）體現(xiàn)載體的具體構(gòu)建環(huán)節(jié)

需闡明體現(xiàn)載體構(gòu)成成分以及重要元件的來源和功效，涉及插入基因和側(cè)翼區(qū)序列、復(fù)制子、啟動子、增強子、抗性標(biāo)記以及重要的酶切位點等。應(yīng)詳述體現(xiàn)載體構(gòu)建或改建的過程。對構(gòu)建成功的體現(xiàn)載體應(yīng)進行必要的鑒定，并提供有關(guān)實驗資料如構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜等。

（三）載體引入宿主細(xì)胞的辦法及重組工程細(xì)胞的篩選

應(yīng)具體闡明載體引入宿主細(xì)胞的辦法和操作過程，重組工程細(xì)胞的篩選原理、條件和原則，以及采用何種辦法增加基因拷貝數(shù)等。敘述外源基因引入宿主細(xì)胞后產(chǎn)生的變化，符合篩選原則的候選細(xì)胞可能為多個細(xì)胞株，但擬用于建庫的細(xì)胞株應(yīng)為經(jīng)研究比較后擬定的單一細(xì)胞克隆。

（四）重組工程細(xì)胞的初步鑒定

應(yīng)檢測重組后細(xì)胞基本性狀的變化，比較研究插入外源基因后細(xì)胞致瘤性特性的變化。應(yīng)闡明體現(xiàn)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)（與否整合到染色體）并采用適宜的辦法測定其拷貝數(shù)。闡明啟動和控制目的基因在宿主細(xì)胞中體現(xiàn)所采用的辦法，并進行初步的體現(xiàn)產(chǎn)物鑒別和體現(xiàn)水平檢測。

對于選定的工程細(xì)胞株應(yīng)進行充足的目的基因全序列確認(rèn)，以確保用于編碼和體現(xiàn)目的產(chǎn)物的基因在初始核酸序列上的對的性。

四、重組工程細(xì)胞庫的建立

持續(xù)傳代細(xì)胞生產(chǎn)重組制品的最大優(yōu)點是使每批產(chǎn)品都有一種通過檢定的共同來源細(xì)胞，因此建立細(xì)胞庫的目的就是為了確保生產(chǎn)的可持續(xù)性和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。重組制品的生產(chǎn)必須建立在良好的細(xì)胞庫管理基礎(chǔ)上。

（一）細(xì)胞庫建立

細(xì)胞庫可為三級即原始細(xì)胞庫、主細(xì)胞庫（MCB）和工作細(xì)胞庫（WCB）；也可采用主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫構(gòu)成的兩級細(xì)胞庫；在某些特殊狀況下，也可使用主細(xì)胞庫一級庫。用于建庫的初始工程細(xì)胞株應(yīng)為通過克隆選擇而形成的均一細(xì)胞群體，必要時須經(jīng)與實際生產(chǎn)過程采用的無血清培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件相一致的適應(yīng)性培養(yǎng)。

（二）建庫細(xì)胞的管理

在制備WCB過程中不得進行單克隆篩選，以避免由于個別基因突變引發(fā)WCB中細(xì)胞群體性的遺傳特性變化；為了確保細(xì)胞庫中每個容器中的內(nèi)容物完全一致，如培養(yǎng)細(xì)胞采用幾個器皿的，應(yīng)將全部培養(yǎng)皿中的細(xì)胞混合成單批后再分裝。

在細(xì)胞庫的建庫期間應(yīng)采用適宜的防止方法，以確保細(xì)胞不被污染（涉及微生物污染和實驗室中其它類型細(xì)胞的交叉污染等）。

上述各級種子庫的細(xì)胞應(yīng)按照特定的規(guī)定通過全方面檢定合格后方可使用（具體規(guī)定參見本文細(xì)胞庫檢定）。

對于細(xì)胞庫建庫的具體過程、辦法和管理的規(guī)定，參見參考文獻[1]。

五、細(xì)胞庫檢定

對的的起始細(xì)胞是實現(xiàn)良好生產(chǎn)的前提和基礎(chǔ)。檢定的目的是為了確認(rèn)通過初步篩選建庫的細(xì)胞符合預(yù)期設(shè)計規(guī)定，攜帶有穩(wěn)定的目的基因，能夠持續(xù)體現(xiàn)有功效活性的目的產(chǎn)物，沒有微生物污染和混雜其它細(xì)胞，能夠直接擴增儲藏或者應(yīng)用于生產(chǎn)。

對于原始庫細(xì)胞和/或主庫細(xì)胞，普通需要進行一次全方面系統(tǒng)的研究檢定，涉及遺傳學(xué)、生物學(xué)和微生物學(xué)，方便從源頭開始嚴(yán)格控制起始細(xì)胞的一致性和避免污染。通過傳代穩(wěn)定性研究的主細(xì)胞到工作細(xì)胞，只通過簡樸的傳代、擴增，能夠適宜簡化檢定項目，重點檢測外源因子污染和避免混入了其它細(xì)胞。保存的數(shù)目和傳代水平應(yīng)確保生產(chǎn)用細(xì)胞的持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)。

（一）細(xì)胞鑒定

1、細(xì)胞種屬的鑒定

應(yīng)驗明細(xì)胞的種屬來源，分析細(xì)胞的同一性，排除與其它細(xì)胞的交叉污染。

現(xiàn)在慣用的辦法有細(xì)胞生長特性和培養(yǎng)形態(tài)學(xué)檢查、種屬特異性抗原檢測、染色體核型分析、同工酶分析、限制性內(nèi)切酶分析、基因多態(tài)性分析等。應(yīng)結(jié)合具體細(xì)胞固有的特性進行適宜的組合和選擇，以實現(xiàn)對的鑒別為目的。

2、致瘤性實驗

應(yīng)檢測分析目的基因引入細(xì)胞后的致瘤性特性，對于陽性細(xì)胞，應(yīng)研究擬定致瘤性特性、強度變化對產(chǎn)品帶來的安全性風(fēng)險。

3、目的基因和體現(xiàn)框架分析

目的基因和體現(xiàn)框架確實證是種子庫細(xì)胞檢定的重要構(gòu)成部分，對于體現(xiàn)對的的目的產(chǎn)物含有先決性意義。慣用的辦法涉及：通過PCR擴增樣本DNA或用從細(xì)胞基質(zhì)中分離的RNA制備的cDNA來進行DNA序列分析；通過限制性內(nèi)切酶譜和Southern雜交來檢測基因的完整性，擬定目的基因的拷貝數(shù)，并檢測與否有任何序列插入或缺失等。

基因序列分析資料應(yīng)涉及實驗方案和環(huán)節(jié)、原始的測序圖、測得序列以及翻譯后的氨基酸序列，同時應(yīng)將實際測得序列與理論序列進行對比。清晰標(biāo)注兩者之間的異同。

為確保產(chǎn)品構(gòu)造的對的和持續(xù)一致，應(yīng)在重組工程細(xì)胞的篩選和鑒定、細(xì)胞庫的建立和檢定、工藝研究過程中的培養(yǎng)終末期及超出終末期一定水平等不同階段，采集代表性細(xì)胞完畢必要的基因序列分析（涉及目的基因側(cè)翼區(qū)域）。

4、體現(xiàn)產(chǎn)物檢測

應(yīng)檢測分析目的產(chǎn)物的體現(xiàn)量和生物活性?；钚詼y定應(yīng)選擇與其治療機理相對應(yīng)并能夠定量的辦法?；钚詼y定辦法學(xué)研究可貫穿于藥品研究的始終，并經(jīng)有關(guān)驗證分析。

（二）微生物污染檢測

1、細(xì)菌、真菌和支原體檢查

應(yīng)對MCB、WCB和工藝研究過程中的EPC（生產(chǎn)終末期細(xì)胞）進行一次全方面檢查，對生產(chǎn)培養(yǎng)過程中的細(xì)胞進行定時監(jiān)測。具體辦法見參考文獻[1]。在進行支原體檢查時，應(yīng)注意同時進行直接培養(yǎng)法和批示細(xì)胞染色法兩種辦法。必要時可采用掃描電鏡法檢查細(xì)胞與否受到特殊微生物的污染。

2、病毒因子的檢查

涉及細(xì)胞來源宿主動物潛在的內(nèi)源性病毒和由于操作帶入的外源性病毒的檢查。對細(xì)胞進行病毒檢查的種類和辦法，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的種屬和組織來源、傳代歷史和細(xì)胞特性選擇。

2.1、體外實驗

應(yīng)將MCB、WCB和EPC細(xì)胞活細(xì)胞或細(xì)胞裂解產(chǎn)物接種到盡量多的病毒易感的批示細(xì)胞上。能夠根據(jù)細(xì)胞來源，傳代史和細(xì)胞培養(yǎng)基的原料使用狀況來選擇適宜的批示細(xì)胞。檢測成果應(yīng)為陰性。具體辦法見參考文獻[1]。

2.2、體內(nèi)實驗

可通過接種乳鼠、成年小鼠、雞胚、豚鼠、家兔或其它敏感動物來檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中潛伏性病毒。普通應(yīng)對MCB、EPC進行體內(nèi)實驗。具體辦法見參考文獻[1]

2.3、特異性病毒的檢定

通過抗體產(chǎn)生實驗來檢測可能存在于MCB細(xì)胞中的特異性病毒，如嚙齒類動物來源的細(xì)胞應(yīng)進行小鼠、倉鼠或大鼠的抗體生成實驗。嚴(yán)格控制對于人類有危害的鼠源性病毒。

2.4、逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測

逆轉(zhuǎn)錄病毒的實驗應(yīng)涉及感染性實驗、逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)檢測和電鏡技術(shù)檢查。應(yīng)采用上述辦法對MCB和EPC細(xì)胞進行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測。

2.4.1、感染性實驗

應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的特性及可能存在的逆轉(zhuǎn)錄病毒種類選擇適宜的檢測辦法，如XC空斑實驗（XCplaque）、延時XC空斑實驗、S＋L－灶點分析（S＋L－Focus）等。實驗時應(yīng)注意設(shè)立恰當(dāng)?shù)年?陽性對照。

2.4.2、逆轉(zhuǎn)錄酶檢測

對于常規(guī)條件下檢測成果為陰性而又高度懷疑的細(xì)胞，為提高檢測的敏感性，可考慮將受試細(xì)胞經(jīng)適宜的化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，收集上清液分別與檢測細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，再檢測逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，注意設(shè)立恰當(dāng)?shù)年?陽性對照。

2.4.3、透射電鏡檢查

透射電鏡下可觀察細(xì)胞基質(zhì)超微構(gòu)造的形態(tài)學(xué)特性以及逆轉(zhuǎn)錄病毒和病毒樣顆粒的存在，應(yīng)比較未經(jīng)和通過化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞。另外，需要對細(xì)胞培養(yǎng)液超速離心后所得的沉淀物經(jīng)負(fù)染后進行檢查。觀察有無逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒以及顆粒的類型。

上述三種辦法含有不同的檢測特性和敏捷度。因此，應(yīng)采用不同的辦法聯(lián)合檢測。若逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測陽性時，建議進行透射電鏡檢查或感染性實驗，如果確證對人或者其它靈長類動物細(xì)胞有感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，該細(xì)胞不得用于生產(chǎn)。

六、細(xì)胞穩(wěn)定性研究

應(yīng)涉及庫細(xì)胞、生產(chǎn)過程中細(xì)胞、生產(chǎn)終末期和/或超出生產(chǎn)終末期一定階段等不同培養(yǎng)時期的細(xì)胞。庫細(xì)胞應(yīng)重點考察貯存、復(fù)蘇等操作解決因素的影響和傳代過程中的遺傳穩(wěn)定性，在此基礎(chǔ)上擬定庫細(xì)胞傳代程度；生產(chǎn)過程中細(xì)胞、生產(chǎn)終末期和/或超出生產(chǎn)終末期一定階段的細(xì)胞應(yīng)考察模擬生產(chǎn)工藝和培養(yǎng)條件對細(xì)胞生長狀況、體現(xiàn)能力等的影響，并擬定生產(chǎn)細(xì)胞增殖程度和/或持續(xù)培養(yǎng)時間；使細(xì)胞始終能夠持續(xù)、穩(wěn)定地體現(xiàn)重組制品，并將對終產(chǎn)品產(chǎn)生安全性影響的風(fēng)險因素嚴(yán)格控制在最低程度。

（一）貯存條件下的穩(wěn)定性

當(dāng)儲存的細(xì)胞復(fù)蘇后用于生產(chǎn)制品時，應(yīng)進行細(xì)胞存活率和功效活性等與細(xì)胞質(zhì)量親密關(guān)聯(lián)項目的研究測定，以證明復(fù)蘇細(xì)胞體現(xiàn)能力的穩(wěn)定性。應(yīng)有對建庫細(xì)胞貯存條件下穩(wěn)定性監(jiān)測的方案。這種監(jiān)測應(yīng)在一支或多支冷凍保藏的WCB復(fù)蘇后制備生產(chǎn)用細(xì)胞時進行，或當(dāng)一支或多支冷凍保藏的MCB復(fù)蘇并用于制備新WCB時進行。如果長時間未進行生產(chǎn)時，應(yīng)按上市申請時所述的間隔時間對生產(chǎn)用細(xì)胞庫進行活力測試。如果細(xì)胞的活力沒有明顯的減退，普通不需對MCB或WCB作進一步檢定。

（二）傳代/擴增過程中的穩(wěn)定性

應(yīng)對庫細(xì)胞和生產(chǎn)過程細(xì)胞進行傳代/擴增的穩(wěn)定性研究，可將復(fù)蘇的庫細(xì)胞持續(xù)傳代培養(yǎng)至一定的代次和將工作庫細(xì)胞在模擬實際生產(chǎn)條件下持續(xù)培養(yǎng)、擴增（逐級放大擴增過程），直至預(yù)期培養(yǎng)時間以及超出預(yù)期時間之外的延長時間點，收獲后進行檢測分析。通過考察目的基因、體現(xiàn)框架等在重組工程細(xì)胞中的傳代穩(wěn)定性和目的產(chǎn)物體現(xiàn)的穩(wěn)定性，制訂庫細(xì)胞的限傳代次和生產(chǎn)細(xì)胞的增殖程度以確保明際生產(chǎn)過程中細(xì)胞整體擴增水平以及隨著的內(nèi)源性病毒和/或致瘤性風(fēng)險等的克制狀態(tài)在預(yù)期程度范疇內(nèi)。最少應(yīng)涉及下列方面的實驗研究：

1、基因水平的比較

目的基因編碼序列和體現(xiàn)框架不應(yīng)有錯誤，涉及突變、缺失、插入。并注意比較基因拷貝數(shù)的變化。

2、目的產(chǎn)物體現(xiàn)水平的比較

目的產(chǎn)物的體現(xiàn)量和體現(xiàn)活性不應(yīng)有明顯減少，根據(jù)不同的產(chǎn)品和具體研究成果擬定適宜的可接受原則。

3、細(xì)胞本身的穩(wěn)定性

應(yīng)重點檢測細(xì)胞在傳代/擴增過程中的形態(tài)、生長、代謝等基本狀況，遺傳特性和致腫瘤特性的變化。

4、內(nèi)源因子檢查

應(yīng)動態(tài)考察內(nèi)源因子的復(fù)制與否得到有效克制。重點檢測由細(xì)胞來源動物和宿主細(xì)胞特性所決定的易染病毒如內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，分析其對于人類的致病性和重要性，嚴(yán)格控制其產(chǎn)生的條件。

5、致瘤性監(jiān)測

應(yīng)通過比較研究考察細(xì)胞培養(yǎng)傳代過程中致瘤性特性的變化，例如實驗陽性時的細(xì)胞代次、最低接種量、腫瘤轉(zhuǎn)移擴散、腫瘤增殖時間、瘤組織病理特性等。

七、生產(chǎn)過程細(xì)胞質(zhì)量控制

種子庫細(xì)胞應(yīng)在全方面質(zhì)量研究和檢測分析基礎(chǔ)上，模擬實際生產(chǎn)過程進行擴增培養(yǎng)，并檢測分析目的基因體現(xiàn)的穩(wěn)定性、細(xì)胞生長狀況、污染控制、致腫瘤風(fēng)險性等；規(guī)?；a(chǎn)后須建立細(xì)胞生產(chǎn)培養(yǎng)過程的監(jiān)控原則，產(chǎn)品生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)終末期應(yīng)符合質(zhì)量控制有關(guān)規(guī)定。

對于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和/或致瘤性實驗陽性的細(xì)胞，應(yīng)根據(jù)工藝解決能力制訂風(fēng)險性成分的控制條件，并根據(jù)模擬生產(chǎn)狀態(tài)下獲得的實驗研究數(shù)據(jù)制訂廢棄收獲液的原則；生產(chǎn)工藝必須涉及有效的病毒和/或致瘤性成分的滅活/去除辦法并通過充足驗證。

在研究建立了培養(yǎng)生產(chǎn)條件之后，如果整個培養(yǎng)過程中的核心環(huán)節(jié)例如培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間和/或限制代次、培養(yǎng)方式等發(fā)生重大改善，細(xì)胞培養(yǎng)工藝進一步放大，且影響了原已擬定的監(jiān)控原則，需要重新調(diào)節(jié)設(shè)立技術(shù)參數(shù)和條件時，應(yīng)重復(fù)進行一次全方面的檢測驗證。

（一）常規(guī)生產(chǎn)過程監(jiān)控

經(jīng)研究擬定了生產(chǎn)工藝條件之后，常規(guī)生產(chǎn)過程中可重點監(jiān)測微生物污染和細(xì)胞生長狀況，例如活細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)、代謝和功效狀態(tài)、目的蛋白體現(xiàn)狀況、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制、外源因子等，在比較分析的基礎(chǔ)上擬定批次或者持續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)的終末細(xì)胞的檢測項目及可接受原則。

（二）細(xì)胞增殖程度

在細(xì)胞穩(wěn)定性實驗研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)、維持等工藝過程中實際采用的生產(chǎn)方式如批式培養(yǎng)（batchculture）、流加培養(yǎng)(fed-batchculture)、灌注培養(yǎng)(perfusionculture)等各自特點，考察細(xì)胞體外持續(xù)擴增、培養(yǎng)過程中發(fā)生的變化，例如細(xì)胞的生長狀態(tài)、內(nèi)源性病毒克制狀態(tài)、目的蛋白體現(xiàn)的下降程度以及致瘤性變化等擬定適宜的收獲方式、收獲時間、細(xì)胞終止培養(yǎng)時間和/或增殖代次，并預(yù)留充足的安全儲藏。實際生產(chǎn)過程中細(xì)胞不得超出預(yù)先設(shè)定的培養(yǎng)時間和/或增殖程度。

（三）其它風(fēng)險性因素控制

培養(yǎng)基對細(xì)胞的質(zhì)量有直接的影響，也是細(xì)胞污染的可能來源之一。應(yīng)明確培養(yǎng)基的構(gòu)成、來源及質(zhì)量原則。對于動物源性添加成分，應(yīng)盡量控制并減少其使用；如確需使用，應(yīng)闡明選擇的理由，并闡明該成分的來源和病毒安全性控制辦法。現(xiàn)在倡導(dǎo)采用無血清培養(yǎng)基，并盡量減少用于解決細(xì)胞（例如從貼壁狀態(tài)中游離或者分散）的動物來源的蛋白酶。多個培養(yǎng)基的來源和質(zhì)量檢測數(shù)據(jù)均應(yīng)有可追溯的文獻統(tǒng)計。如培養(yǎng)中使用了牛源性物質(zhì)，應(yīng)明確其來自非BSE疫區(qū)，并應(yīng)按照國家食品藥品監(jiān)督管理局的有關(guān)規(guī)定提供必要的證明性文獻。

細(xì)胞培養(yǎng)條件的研究中，對于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和/或致瘤性實驗陽性的細(xì)胞，在權(quán)衡風(fēng)險性基礎(chǔ)上開展必要的研究，關(guān)注病毒和/或癌基因有關(guān)序列的激活或者復(fù)制狀況。

八、小結(jié)

宿主細(xì)胞來源應(yīng)明確，其建立、傳代和保存過程清晰，鑒定成果可靠，遺傳、生物學(xué)背景可追溯；

工程細(xì)胞的克隆構(gòu)建、篩選過程應(yīng)規(guī)范，克隆原始細(xì)胞在比較優(yōu)化的基礎(chǔ)上通過確認(rèn)檢測；起始細(xì)胞穩(wěn)定、均一和同質(zhì)，建立了規(guī)范的細(xì)胞庫（下列簡稱庫細(xì)胞）并通過充足檢定，保存的數(shù)目和傳代水平應(yīng)確保生產(chǎn)用細(xì)胞的持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)；

對于原始庫和/或主庫細(xì)胞，應(yīng)進行過最少一次全方面系統(tǒng)的研究檢定；工作庫細(xì)胞通過簡化項目的檢定和外源因子污染檢測，沒有混入其它細(xì)胞；

生產(chǎn)用WCB細(xì)胞每次復(fù)蘇后應(yīng)通過有代表性意義的常規(guī)質(zhì)控項目的檢測分析，以證明庫細(xì)胞在復(fù)蘇時仍保持凍存時原有的細(xì)胞特性。

細(xì)胞應(yīng)通過全方面的穩(wěn)定性研究考察，以擬定庫細(xì)胞的限傳代次和生產(chǎn)細(xì)胞適宜的擴增控制水平，并在生產(chǎn)過程中嚴(yán)格執(zhí)行限定的規(guī)定。重組工程細(xì)胞在整個培養(yǎng)生產(chǎn)過程中其遺傳學(xué)和生物學(xué)特性應(yīng)保持穩(wěn)定；對于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和/或致瘤性實驗陽性的細(xì)胞，在權(quán)衡風(fēng)險性基