中國對蝦人工授精方法的建立

中國對蝦人工授精方法的建立

在對日本蝦加工方法的研究中，許多研究是精細(xì)移植和對室外蝦加工的研究。Persyn最早研究成功對蝦精莢移植方法,他用手?jǐn)D壓雄性對蝦第5對步足基部的精莢囊,將擠出的精莢粘貼在雄性對蝦腹部,該方法應(yīng)用于具開放式納精囊的對蝦類。Sandifer等采用相同的方法對羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)進(jìn)行了人工授精,并在1980年研究使用電刺激法獲取精莢并獲得成功。此后Muthu等和Lin等將人工精莢移植技術(shù)應(yīng)用到斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)也獲得了成功。楊叢海等應(yīng)用改進(jìn)的電刺激裝置采集中國對蝦雄蝦的精莢,并進(jìn)行了人工授精實(shí)驗(yàn)。在體外人工授精方面,Clark等以褐對蝦(Penaeusaztecus)為實(shí)驗(yàn)材料,將解剖的卵子和精子混合,首次獲得了蝦類體外人工授精的成功,但受精率僅10%,且重復(fù)性較差。Lin等研究過斑節(jié)對蝦的人工體外授精,選用未交尾的雌蝦,在雌蝦產(chǎn)卵前后的不同時刻,將精液加到不同容積的產(chǎn)卵池中,分別獲得了63.11%,52.29%和49.44%的孵化率。孔杰等和包振民等也就中國對蝦的體外人工授精技術(shù)方法進(jìn)行過研究。雖然精莢移植技術(shù)已經(jīng)成功用于中國對蝦的人工繁殖,但在建立家系進(jìn)行中國對蝦選擇育種方面,精莢移植法建立半同胞家系的數(shù)量和成功率都有一定限度,不能很好滿足中國對蝦選擇育種所需建立的全同胞和半同胞家系數(shù)量,家系數(shù)量不足會影響到遺傳參數(shù)估算的準(zhǔn)確性,以及對每個世代留種個體的育種值和選擇指數(shù)造成偏差。而體外人工授精需要?dú)⑺来莆r或靜候母體產(chǎn)卵,十分費(fèi)時費(fèi)力,在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用受到限制。因此,需要改進(jìn)或嘗試建立新的人工授精技術(shù)來建立足夠的全同胞和半同胞家系,以保證各種參數(shù)的準(zhǔn)確性和育種工作的順利進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用完整精莢移植和輸精管移植,并嘗試精莢切塊移植和精液移植進(jìn)行中國對蝦的人工授精,對比了4種方法的授精成功率、受精率和幼體的孵化率,最終獲得了101個全同胞家系,和29個半同胞家系,為以后的選擇育種工作打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1越冬親蝦的選擇實(shí)驗(yàn)在黃海水產(chǎn)研究所鰲山衛(wèi)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行,材料采用未交尾的越冬親蝦:乳山灣海捕中國對蝦、青島近海海捕中國對蝦和朝鮮群體養(yǎng)殖二代中國對蝦,以及黃海所鰲山衛(wèi)實(shí)驗(yàn)基地的養(yǎng)殖親蝦。1.2精莢移植的方法2005年3月24-25日,采用4種人工授精方法,對未交尾雌蝦進(jìn)行人工授精。完整精莢移植法:取雄蝦、雌蝦各1尾,用酒精棉球擦拭體表。用手?jǐn)D壓雄蝦第五對步足基部的精莢壺腹部,擠出精莢,小心地剝?nèi)ゾv囊,剪去瓣?duì)铙w,用鑷子夾住瓣?duì)铙w基部,將整個精莢放入撐開的未交尾雌蝦納精囊中。輸精管移植法:將輸精管中端部分取出,所取輸精管長短要根據(jù)雌蝦納精囊的大小進(jìn)行調(diào)整,一般0.5~1.5cm左右,移植到雌蝦納精囊中。精莢切塊移植法:將精莢切塊,一個精莢可以切成2~3塊,然后分別移植到幾尾雌蝦的納精囊中。精液移植法:取已交尾的雌蝦,用酒精棉球擦拭體表,特別是納精囊部位,然后用手?jǐn)D壓納精囊,使精子團(tuán)露出,用消毒過的注射針頭蘸取適量精液,根據(jù)精液量的多少分成多份,分別移植到未交尾雌蝦納精囊中。一般1尾雌蝦納精囊中的精液可以移植到2~4尾雌蝦中。1.3親蝦的授精成功率將人工授精后的親蝦每尾單獨(dú)置于室內(nèi)2.8m3(2m×1m×1.4m)的方缸中,將水溫控制在14℃,促其產(chǎn)卵。實(shí)驗(yàn)用水為沙濾水,鹽度25~29,pH8.2~8.6。親蝦產(chǎn)卵后,根據(jù)是否出現(xiàn)受精卵,采用授精成功率指標(biāo)來衡量4種移植方法各自的授精成功情況。授精成功率為該移植方法中出現(xiàn)受精卵的親蝦數(shù)與采用該方法總共移植的親蝦數(shù)的比值。每天觀察產(chǎn)卵情況,在親蝦產(chǎn)卵后,隨機(jī)收集200粒卵在顯微鏡下觀察,統(tǒng)計(jì)受精率。受精率為受精卵數(shù)與所收集卵子的總數(shù)之比,以出現(xiàn)受精膜和能進(jìn)行正常細(xì)胞分裂為指標(biāo)。產(chǎn)卵后將親蝦撈出,將水溫緩慢升至16~18℃,進(jìn)行幼體孵化,并計(jì)算變成無節(jié)幼體時的孵化率。孵化率為無節(jié)幼體數(shù)量與受精卵數(shù)量的比值。1.4處理數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS分析軟件對4種方法獲得的平均受精率和平均孵化率進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),比較其差異顯著性。2結(jié)果與分析2.14不同人工體外授精方法獲得的成功率比較4種人工授精方法移植的親蝦數(shù)、授精成功的親蝦數(shù)及授精成功率見表1。從表1可以看出,4種人工體外授精方法均獲得了較高的授精成功率,都在50%以上。其中,完整精莢移植的授精成功率最高,為80.8%,輸精管移植的授精成功率最低,為53.3%。2.24采用人工精測法的顯著性統(tǒng)計(jì)對出現(xiàn)受精的卵進(jìn)行受精率統(tǒng)計(jì),每種方法的平均受精率見表1。從表1可以看出,4種人工體外授精方法均獲得了較高的平均受精率。2.34幼被孵化的培養(yǎng)情況對受精卵變成無節(jié)幼體的孵化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示,4種人工授精方法獲得的幼體平均孵化率均很高,都在80%以上,具體見表1。無節(jié)幼體經(jīng)選優(yōu)后,取2萬尾進(jìn)行培育,發(fā)育到仔蝦階段時統(tǒng)計(jì)家系數(shù)量,總共獲得的全同胞家系數(shù)量為101個,半同胞家系的數(shù)量為29個,每個家系蝦的平均數(shù)量在5000尾左右。2.4總體受精率的測定4種人工授精方法獲得的平均受精率和平均孵化率經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析,結(jié)果顯示:4種人工授精方法獲得的平均受精率之間和平均孵化率之間均差異不顯著(P>0.05)。3討論3.1營造良好的模范作用,進(jìn)行精密度調(diào)整影響人工授精效果好壞的因素很多,為了獲得好的授精成功率和受精率,首先在挑選親蝦時,要選擇發(fā)育良好、身體健康的雌蝦和雄蝦。另外,對蝦精子也像許多水生生物的精子一樣,在沒有卵子存在的情況下,入海水后發(fā)生頂體反應(yīng),并因此而失去受精能力。發(fā)生頂體反應(yīng)的精子越多,受精能力越弱,因此在移植過程中,特別是進(jìn)行精莢切塊移植、輸精管移植和精液移植時,不要讓移植部分接觸海水。再次,在人工授精操作過程中,要確保操作的準(zhǔn)確性和整個過程的消毒工作。在操作過程中,盡量不要讓雌蝦受傷,特別是雌蝦的納精囊底部,由于該部位血管豐富,如果不小心碰破,會引起血管破裂,血液溢滿納精囊,影響受精,從而導(dǎo)致移植失敗。對于輸精管移植,精子質(zhì)量好壞會直接影響到受精效果,而輸精管不同部位的精子成熟度是不同的,吳長功等的研究表明,中國對蝦的輸精管可分為近端、中間、遠(yuǎn)端輸精管及壺腹4部分,精子在精巢內(nèi)產(chǎn)生,并在輸精管內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育為精子,成熟的精子被輸送到壺腹內(nèi),聚集成團(tuán),外包膠體物質(zhì),形成精莢。陳俅等研究表明,精子進(jìn)入輸精管中段時與該處分泌物相混合形成精子團(tuán),并在該處停留較長時間,故中段輸精管兼有輸精和貯精的功能。本實(shí)驗(yàn)用越冬雄蝦的輸精管進(jìn)行人工受精,獲取部位是輸精管中端部分,移植時間是3月底和4月初,獲得了66.8%的平均受精率,其中最高受精率為94.8%,并進(jìn)一步驗(yàn)證了王清印等得出的越冬雄蝦輸精管中的精子已達(dá)成熟程度,并具有受精能力的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)首次采用精液移植法進(jìn)行中國對蝦的繁殖并獲得成功,其平均受精率為46.8%,最高受精率為78%。對于獲得的平均受精率不高,我們分析原因可能是移入的精子團(tuán)體積小,使雌蝦納精囊沒有形成有效的刺激而使納精囊閉合不緊,造成少量海水滲進(jìn)而使部分精子失活,但在雄蝦不足時,此方法仍可以用于中國對蝦的家系建立。3.2不同社會公眾對體外人工授精的要求楊叢海等應(yīng)用改進(jìn)的電刺激裝置采集中國對蝦雄蝦的精莢,使用未交配雌蝦進(jìn)行人工授精,每尾雌蝦的納精囊中移植1個精莢,成功率為35%~75%,其中1尾雌蝦產(chǎn)卵后受精率最高達(dá)93.6%,該蝦后來再次產(chǎn)卵,受精率仍達(dá)94%。在本實(shí)驗(yàn)中,4種授精方法的授精成功率為50%~80.8%,獲得的最高受精率分別為97.5%、94.8%、98.2%、和78%,可見,這4種授精方法也可以取得理想的授精效果。在中國對蝦體外人工授精研究方面,孔杰等采用干法授精、濕法授精、半濕法授精和滴管法授精,獲得平均的受精率依次為27.73%、40.02%、27.53%和61.62%。本實(shí)驗(yàn)采用完整精莢移植和輸精管移植獲得的平均受精率分別為66.2%,66.8%,最新嘗試的精莢切塊移植和精液移植,其平均受精率分別為65.4%、46.8%,獲得的幼體平均孵化率均在80%以上。由于體外人工授精需要?dú)⑺来莆r或靜候母體產(chǎn)卵,十分費(fèi)時費(fèi)力,故在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用受到限制,而人工移植授精法,只要有性成熟個體,于母體產(chǎn)卵前隨時都可進(jìn)行人工移植,勿需為了掌握受精時機(jī)而長時間等候母體產(chǎn)卵,故在生產(chǎn)上具有較強(qiáng)實(shí)用性。由此可見,在中國對蝦選擇育種過程中,可以采用以完整精莢移植和精莢切塊移植的方法,在雄蝦不足時可以結(jié)合輸精管移植和精液移植為補(bǔ)充的方法來建立大量的同胞和半同胞家系。3.34種人工授精方法在精莢切蝦的移植外增加了建立半保在建立半同胞家系方面,1尾雄蝦有兩個精莢,若采用完整精莢移植法,1尾雄蝦最多可與兩尾雌蝦進(jìn)行移植,若兩尾雌蝦均能產(chǎn)生后代,則建立半同胞家系的數(shù)量為1個,若其中1尾不能產(chǎn)生后代或兩尾都沒有后代,則不能建立半同胞家系。而對于精莢切塊移植和精液移植,由于可以與多尾(2~4尾)雌蝦進(jìn)行移植,故提高了讓更多雌蝦產(chǎn)生后代的可能性,所以增加了建立半同胞家系的機(jī)會。另外,