水稻外源基因擴散的環(huán)境安全性

水稻外源基因擴散的環(huán)境安全性

水稻抗蟲（bt、cpti）、抗病性（x21）、抗旱性（bar）、抗旱性、抗鹽性和改進品質(zhì)的科學(xué)研究取得了重大進展，并允許轉(zhuǎn)移稻田的營銷生產(chǎn)。但轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)安全性和食用安全性至今沒有定論。因此,轉(zhuǎn)基因水稻的花粉擴散及由此產(chǎn)生的基因飄流規(guī)律的研究迫在眉睫。水稻花粉擴散濃度的分布與多數(shù)微粒的擴散形式一樣,符合尖峰態(tài)分布,與氣象因子的關(guān)系十分密切,尤其是風(fēng)速、風(fēng)向、沉降速度、湍流強度。近年來,廣泛地應(yīng)用模型來研究轉(zhuǎn)基因作物的花粉擴散及由此產(chǎn)生的基因飄流問題。比如,指數(shù)或乘冪等類型的經(jīng)驗?zāi)Ｐ捅粦?yīng)用于花粉濃度和基因飄流率分布的模擬以及最佳隔離距離預(yù)測。此外,大氣擴散模型也是一個重要的解決途徑,比經(jīng)驗?zāi)Ｐ透哂衅者m性。研究的結(jié)果表明,IDF(individualdispersalfunction)或Kernels模型模擬花粉擴散時發(fā)現(xiàn)這類模型比指數(shù)類的模型更符合花粉的擴散曲線,尤其是在長距離擴散或是擴散濃度衰減較慢時預(yù)測的效果會更好。其次,還有大量以Lagrangian理論為基礎(chǔ)的花粉擴散模式,如Lagrangianrandom-flightmodel和Raupach所提出局地近場模型(LNF,Localisednearfield)。高斯煙羽模型(GPM,Gaussianplumemodel)的應(yīng)用雖然不多,但是基因飄流較為簡便的模式,作者認(rèn)為在區(qū)域性的基因飄流風(fēng)險評估中具有廣闊的應(yīng)用前景。Spijkerboer等僅利用云量、風(fēng)速和時間資料,曾實現(xiàn)了馬鈴薯冠層上方孢子擴散的模擬。而且,Loos等對比高斯煙羽模型和局地近場模型的結(jié)果,也證實了離源大于7.5m時高斯煙羽模型同樣適合模擬花粉擴散與基因飄流。但是無論是哪種模型,都必須考慮到如何在自然條件下獲取模型的參數(shù)。因此,為將研究結(jié)果應(yīng)用于我國轉(zhuǎn)基因商業(yè)化生產(chǎn)過程前及過程中的基因飄流風(fēng)險評估,本研究擬以高斯煙羽模型為基礎(chǔ),結(jié)合水稻的開花習(xí)性特點,通過最小二乘法來估算花粉釋放率,建立水稻的花粉擴散模型,揭示其濃度分布的規(guī)律與氣象條件的關(guān)系。1材料和方法1.1試驗田總體及試驗設(shè)計本試驗以兩優(yōu)培九(OryzasativaL.cv.indica)為材料,分別于2007年在南京信息工程大學(xué)的農(nóng)業(yè)氣象試驗站(試驗1)、于2009年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物基地(試驗2)進行了2次水稻花粉擴散的田間試驗。試驗1試驗田總面積約12000m2,東西向長約120m,南北向?qū)捈s100m?；ǚ墼疵娣e約為900m2,位于試驗田東南側(cè),長寬均為30m左右,其東西向平坦開闊。試驗期間的盛行風(fēng)向為東風(fēng),花粉源下風(fēng)方向約90m內(nèi)為水稻田,90m以外為裸地?；ǚ墼礊閮蓛?yōu)培九,播種期為2007年5月10日,秧齡為30d,移栽密度為26cm×23cm,始花期為8月22日,末花期為8月29日,平均株高為1.1m。除花粉源外,試驗田內(nèi)還種植武育粳3號,為避免武育粳3號的花粉干擾試驗,采用了花期隔離的方式,播種期為2007年5月20日,開花期為2007年9月2—9日。試驗田周圍未種植其他作物。試驗2試驗田總面積為約300000m2,平坦開闊,東西向?qū)捈s300m,南北向長約1000m。其中花粉源面積約為2500m2,位于試驗田中間,長寬均為50m左右。試驗期間盛行風(fēng)向為偏東風(fēng),花粉源的下風(fēng)方向100m內(nèi)為水稻田,100m以外為灌溉渠和網(wǎng)室。試驗以兩優(yōu)培九為材料,播種期為2009年6月20日,秧齡為20d,移栽密度為26.5cm×14.5cm,開花期為2009年9月18—26日,平均株高1.0m。除花粉源外,試驗田內(nèi)其余水稻品種大多在9月15日前結(jié)束開花,試驗期間剩余少量的開花植株在每日載玻片放置前人工割除。1.2觀測方法和內(nèi)容1.2.1花粉捕收點設(shè)置花粉源開花期間,即2007年8月22—29日(8月28日,雨,未觀測)和2009年9月19—25日(9月21日,雨,未觀測),組織花粉擴散試驗,于盛行風(fēng)下風(fēng)方向的0—100m區(qū)域內(nèi)為花粉捕捉區(qū),放置若干花粉捕捉點,測定不同距離不同高度上的花粉濃度。其中,2007年在捕捉區(qū)內(nèi)共設(shè)置了32個花粉捕捉點,位于4條平行于風(fēng)向的射線上,每條射線上各有8個捕捉點,分別距離花粉源0、1、2、5、10、20、50、80m;2009年在花粉源的正東方向設(shè)置了9個花粉捕捉點,分別距離花粉源4、7、10、15、20、40、60、80、100m,在東北方向和東南方向各設(shè)置2個捕捉點,分別距離花粉源20m和40m?；ǚ鄄蹲近c的高度為1.0—1.1m,位于水稻穗頂,由3片水平放置和3片垂直放置的載玻片組成,每片載玻片上涂上凡士林以粘附擴散的花粉。在試驗期,每日開花前將載玻片放置于田間的花粉捕捉點,并于開花結(jié)束后收回所有載玻片。取回的載玻片用100倍的電子顯微鏡讀取20個視野的平均花粉量,除以視野面積以計算單位面積的花粉粒數(shù)。1.2.2溫度和濕度測定采用PTWD-2A型溫度傳感器和PTD-2A型濕度傳感器分別測定8個高度(1.0、1.6、2.5、3.2、4.2、5.7、7.2、10.0m)的溫度和濕度,采用EC-9S型數(shù)字風(fēng)速傳感器測定5個高度(1.6、2.8、4.2、7.2、10.0m)的水平風(fēng)速,采用EC-9X型風(fēng)向傳感器測定10.0m處水平風(fēng)向及其風(fēng)向脈動角,用TBQ-2型總輻射表測定冠層上方的總輻射強度。以上數(shù)據(jù)用TRM-ZS1型氣象生態(tài)環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng),每10s采集一次,每30min存儲一組平均值。1.2.3出穗速度和花期動態(tài)各試驗分別選取5個觀測小區(qū),每個小區(qū)有25株(5株×5株),每日下午掛牌統(tǒng)計各小區(qū)當(dāng)日新抽出葉鞘的穗數(shù),計算兩優(yōu)培九的出穗速度。于花粉擴散試驗的同期,選取30穗掛牌觀測其每日開花動態(tài)。在7:00—15:00的各整點之間調(diào)查開花的穎花數(shù),并于記錄后剪去已開放的穎花,直到掛牌穗上的穎花全部開放完畢為止。計算30穗的平均值反映全天的開花動態(tài)。2小面源劃分及擴散參數(shù)2.1GaussianPlumeModel(GPM)的應(yīng)用在均勻定常的湍流場,假定稻田連續(xù)均勻地釋放花粉粒,且釋放的花粉粒全部被水稻冠層和附近地面吸收,則可用連續(xù)點源的高斯煙羽模型(GaussianPlumeModel,GPM)描述下風(fēng)方向的水稻花粉濃度,即:q(x,y,z)=Q(i,j,H)2πuˉHσyσzexp[?(y?j)22σ2y?(z?H)22σ2z](1)q(x,y,z)=Q(i,j,Η)2πuˉΗσyσzexp[-(y-j)22σy2-(z-Η)22σz2](1)式中,q為下風(fēng)方向(x,y,z)位置的花粉濃度(粒/m3);Q為花粉源強(粒/s),(i,j,H)為花粉源的坐標(biāo)位置;uˉuˉH為H高度處的平均風(fēng)速(m/s);σy、σz分別為側(cè)向和垂直向的擴散參數(shù)(m)。公式(1)用花粉源位置確定原點,以開花期的盛行風(fēng)向為y軸建立坐標(biāo)系。當(dāng)盛行風(fēng)向與模擬時段的平均風(fēng)向不一致時,用(2)式進行坐標(biāo)轉(zhuǎn)換:q(x′,y′,z)=q(cosθ·x+sinθ·y,cosθ·y-sinθ·x,z)(2)2.2面源的花粉擴散當(dāng)?shù)咎锩娣e較大時,近似點源的處理誤差較大。這里將大面源劃分為1m×1m的若干小面源,將每個小面源簡化為點源,采用點源的GPM公式(1),則Mm×Nm的花粉源在下風(fēng)方向(x,y,z)處的花粉濃度q′(x,y,z)則可修正為:q′(x,y,z)=∑i=?M/2N/2∑j=?N/2N/2q(x,y,z)(3)q′(x,y,z)=∑i=-Μ/2Ν/2∑j=-Ν/2Ν/2q(x,y,z)(3)2.3花粉擴散的累積量理論上,若不考慮玻片對氣流的影響,單位時間內(nèi)落在玻片上的花粉粒數(shù)應(yīng)該是空氣中花粉濃度與風(fēng)速的乘積,即uˉH×q′(x,y,z)uˉΗ×q′(x,y,z)(粒/(m2·s)),進而得到單位面積日花粉累積量∑q′(x,y,z)(粒/(m2·d))為:∑q′(x,y,z)=∑[uˉH×q′(x,y,z)×Δt](4)∑q′(x,y,z)=∑[uˉΗ×q′(x,y,z)×Δt](4)2.4擴散參數(shù)σy、σz風(fēng)向脈動標(biāo)準(zhǔn)差可以直接反應(yīng)湍流對花粉微粒的擴散稀釋能力,本研究用風(fēng)向脈動與擴散函數(shù)法確定擴散參數(shù),即:σy=σA·x·fy(x)σz=σE·x·fz(x)(5)式中,x為與花粉源距離;σA、σE分別為風(fēng)向方位角與高度角脈動的標(biāo)準(zhǔn)差,由超聲風(fēng)速儀直接觀測并計算得到;fy、fz為擴散函數(shù),利用Draxler給出的f值計算公式進行估算:fy,z=1/[1+0.9(T/Ti)0.5](6)其中,T為擴散時間(T=x/uˉH)(Τ=x/uˉΗ);Ti為特征時間,即fy或fz等于0.5時的擴散時間,Draxler確定其值分別為300s和50s。2.5穗部風(fēng)速uˉuˉH根據(jù)近地層風(fēng)速垂直分布的觀測,在數(shù)米以下的貼地層風(fēng)速垂直分布呈對數(shù)率,即:uˉ=u?κLnz?dz0uˉ=u*κLnz-dz0其中uˉuˉ為z(m)高度處的平均風(fēng)速(m/s);u*為摩擦速度(m/s);κ為卡門常數(shù)(取0.4);d為零平面位移高度(m),這里取0.63H;z0為粗糙度高度(m)。u*和z0用5個高度的風(fēng)速觀測資料以最小二乘法估算,得到z0的平均值為0.10m。uˉuˉH則由可(8)式估算:uˉH=uˉ10?ln[(H?d)/z0]/ln[(10?d)/z0](8)uˉΗ=uˉ10?ln[(Η-d)/z0]/ln[(10-d)/z0](8)2.6模型的調(diào)試和驗證(1)式中的花粉源強Q是非常重要的輸入值,但由于水稻花粉量大(每朵穎花的花粉量約10000粒)且花粉微粒小(直徑約42μm),難以準(zhǔn)確測量不同時刻的花粉源強。因此,本研究利用試驗1的數(shù)據(jù)(7d試驗,198組樣本)通過最小二乘法估計每日每小時水稻花粉的平均釋放量,即∑[∑q′sin-∑q′obs]2→min(9)(9)式中,n為觀測樣本數(shù);sim表示模擬值,obs表示實測值;∑q′為每日花粉擴散量。為驗證花粉擴散模型的可靠性,用試驗2的數(shù)據(jù)(8d試驗,104組樣本)對花粉濃度的模擬值和實測值進行比較。均方根誤差(Rootmeansquareerror,RMSE)和相對誤差(Relativeestimationerror,RE)描述模型的預(yù)測效果。但花粉擴散濃度隨距離的增加指數(shù)形式衰減,若直接計算濃度的RMSE和RE,會擴大近源處花粉濃度(高濃度)的預(yù)測效果,而忽略了遠(yuǎn)緣處的預(yù)測效果。因此,本研究用花粉濃度的對數(shù)值計算RMSE和RE,即:RMSE=∑[ln(∑q′simt)?ln(∑q′obs)]2/n????????????????????????????√(10)RΜSE=∑[ln(∑q′simt)-ln(∑q′obs)]2/n(10)RE=RMSE/[ln(∑q′obs)/n](11)RMSE和RE值越小,表明模擬值與實測值的偏差小,模擬效果好。3結(jié)果與分析3.1花粉的釋放和釋放利用試驗1的數(shù)據(jù)通過最小二乘法估計的每日每小時水稻花粉源強如圖1所示。結(jié)果顯示,整個花期的花粉釋放集中在始花期后的第1天到第5天,占總量的90%以上,其中第3天是釋放的高峰日,占總量的1/3左右。而日09:00—11:00則是花粉釋放的高峰段。兩者的相關(guān)程度更達(dá)到0.01以上的顯著水平(r=0.880**,n=35)。可見,花粉源強的變化規(guī)律與水稻的開花習(xí)性基本一致,開花量是決定花粉釋放的主要因素。3.2/回歸方程結(jié)果及方差分析為驗證花粉擴散模型的可靠性,將ln(∑q′)的模擬值與實測值進行對比。結(jié)果如圖2所示,由104個樣本得出模擬值和實測值的相關(guān)程度為0.866,達(dá)到0.01的顯著水平。其次,模擬值和實測值回歸方程的系數(shù)接近1且R2=0.672**。可見,模擬值ln(∑q′sim)與實測值ln(∑q′obs)的變化趨勢一致?；ǚ蹟U散日累積量的預(yù)測值均方根誤差為0.509粒/(m2·d),相對誤差為3.47%,花粉擴散模型可以反映多種環(huán)境條件下(uˉuˉH變化在0.3—4.3m/s)花粉擴散濃度的分布特征。但在低花粉濃度環(huán)境下,其均方根誤差存在增大的趨勢,因此在預(yù)測花粉遠(yuǎn)距離傳播時,模型的預(yù)測效果仍需要改善。4討論4.1影響種子純度和質(zhì)量以及多樣性水稻雖是自花授粉作物,但仍有0.2%—0.3%的天然異交率,而且還會隨著外來花粉濃度的增加上升到1%—4%左右。因此,不同品種水稻間存在著天然的基因飄流現(xiàn)象。栽培水稻不同品種間的基因飄流,會導(dǎo)致受體品種的種子純度和質(zhì)量發(fā)生下降。尤其我國是雜交稻生產(chǎn)大國,年種植面積1500萬hm2左右,在雜交稻制種過程中有大量不育系,由于其不產(chǎn)生有活力的花粉,外來水稻花粉落至不育系柱頭上可導(dǎo)致很高的異交率,從而影響種子的純度。此外,我國南方8省又有普通野生稻(OryzarufipogonL.)分布,它們與栽培稻(O.sativaL.)同具AA基因組,可天然雜交,無種間生殖隔離屏障,會影響野生稻群體的遺傳組成和遺傳結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)基因水稻的環(huán)境釋放和商品化生產(chǎn),可能會使得外源轉(zhuǎn)基因通過基因飄流擴散至非轉(zhuǎn)基因水稻品種及其野生近緣種,從而可能會引發(fā)一系列的生物安全問題。4.2水稻花粉擴散的時空分布及變化花粉擴散和基因飄流是兩個不同的概念。只有擴散出去的活花粉在受體花柱中萌發(fā)并受精結(jié)實后才會產(chǎn)生基因飄流,花粉擴散是基因飄流的前提,只有在花粉擴散的距離范圍內(nèi),才可能發(fā)生基因飄流。因此,水稻花粉擴散研究是基因飄流的重要基礎(chǔ)。水稻花粉粒徑平均約為42—43μm,與