拉曼光譜在血紅蛋白研究中的應用

拉曼光譜在血紅蛋白研究中的應用

血紅蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究中拉曼光譜的應用血液不僅具有將氧氣分配到身體各部分的重要生理功能，而且還具有調(diào)節(jié)ph值的能力。調(diào)整一氧化氮水平，參與免疫反應。盡管一直作為描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的重要范例,但是當前對血紅蛋白的認識仍滯后于大量臨床病例診治的需求［１］。同時,鑒于血液安全保障形勢日益嚴峻,血紅蛋白氧載體(hemoglobin-basedoxygencarriers,HBOCs)作為紅細胞代用品的主要類型,其研制為血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能的認識不斷提出新要求［２］。拉曼光譜是一種與分子或晶格振動相關(guān)的光子非彈性散射光譜,可用于分子結(jié)構(gòu)分析。在血紅蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究中,拉曼光譜具有三方面突出優(yōu)勢:第一,樣品準備簡單,避免稀釋液等對血紅蛋白結(jié)構(gòu)的影響;第二,可進行實時、原位檢測,使在體或無損檢測成為可能;第三,光譜信息量大,可同時分析不同化學鍵的振動方式。1972年Strekas和Spiro的工作揭開了拉曼光譜研究血紅蛋白結(jié)構(gòu)的新篇章［３］。近年來,血紅蛋白中血紅素平面及其與鐵離子軸向配體鍵的拉曼光譜歸屬的深入研究,不僅為揭示血紅蛋白反應動力學及相關(guān)機制奠定基礎(chǔ),還為病變血紅蛋白的檢測與診斷提供了實驗依據(jù),并可定量評估血氧飽和度和高鐵血紅蛋白含量。本文將從這些方面綜述血紅蛋白拉曼光譜的研究進展。1血紅蛋白拉曼光譜峰位歸屬通過拉曼光譜峰位的歸屬分析可以得到官能團、化學鍵和電子密度等分子結(jié)構(gòu)及其變化的信息［４］。由于血紅素拉曼散射截面相對較大,因此血紅蛋白的拉曼光譜主要反映血紅素振動特征［５］。研究者們通過同位素標記血紅素中鐵離子、吡咯環(huán)中氮原子、次甲基中氫原子以及改變其周圍取代基,結(jié)合血紅蛋白拉曼光譜峰頻率和強度變化,確定了血紅蛋白拉曼光譜峰的歸屬。Abe等將對稱性為D４ｈ血紅素分子的核心卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)進行了簡正坐標分析,為血紅蛋白的拉曼光譜峰位歸屬提供了依據(jù),其結(jié)果經(jīng)整理列于表1中［６］。血紅蛋白拉曼光譜受血紅素環(huán)內(nèi)電子密度、血紅素中心尺寸(Hemecoresize)、鐵離子自旋態(tài)以及鐵離子-血紅素環(huán)表面距離等影響發(fā)生變化。高頻區(qū)(1200~1700cm－１)反映血紅素環(huán)骨架振動模式,是血紅素結(jié)構(gòu)變化的敏感譜帶;低頻區(qū)(200~700cm－１)反映血紅素平面和鐵離子軸向配體鍵的微小變形(圖1)［７］。1.1生物資本的熱重wbf-甲基-n原子間關(guān)系及選擇血紅素環(huán)骨架振動模式可分為BandⅠ-Ⅵ(表2)。BandⅠ為血紅素環(huán)內(nèi)電子密度敏感譜帶,其波數(shù)范圍為1340~1390cm－１,是血紅素氧化還原態(tài)的標志譜帶,且不受自旋態(tài)影響,與四個吡咯環(huán)的相同呼吸振動有關(guān),很大程度上歸屬于Cα—N的對稱拉伸。當Fe的氧化態(tài)降低時,反饋到卟啉π＊軌道d電子隨之增加,卟啉π電子密度降低,C—N伸縮振動頻率降低,拉曼光譜中BandⅠ頻率降低［６］。例如高自旋HbⅢF(氧化型Hb氟化物)和低自旋HbⅢCN(氧化型Hb氰化物)的BandⅠ頻率出現(xiàn)在1373cm－１,高自旋的de-oxyHbⅡ(還原型脫氧Hb)的BandⅠ頻率出現(xiàn)在1357cm－１［８］。出現(xiàn)在1470~1650cm－１的拉曼光譜峰反映了血紅素中心與吡咯環(huán)N原子之間的距離。根據(jù)極化情況不同,該區(qū)段分為BandⅡ-Ⅵ,為血紅素中心尺寸相關(guān)振動譜帶。其中,極化、去極化及反常極化是由拉曼光譜中的退偏比(ρ１)決定的,ρ１<1/3為極化,ρ１=3/4為去極化,ρ１>3/4為反常極化［３，６］。這幾種振動帶是鐵離子自旋態(tài)敏感譜帶,受血紅素環(huán)內(nèi)電子密度影響小,主要受次甲基鍵伸縮振動的影響。BandⅡ,Ⅳ和Ⅴ與次甲基鍵(Cα—Cｍ和Cα—Cβ)拉伸模式有關(guān),BandⅥ與Cβ—Cβ拉伸模式有關(guān)。當Fe離子由低自旋態(tài)變?yōu)楦咦孕龖B(tài),Fe與吡咯環(huán)N原子之間距離增大,鍵長增長,血紅素中心尺寸增大,dx２—y２反鍵軌道電子密度增高,BandⅡ,Ⅳ和Ⅴ頻率左移［７］。已有研究提出BandⅡ-Ⅵ的拉曼頻率與血紅素中心尺寸大小呈線性關(guān)系［９］,即νｉ=Kｉ(Aｉ-RＣｔ—Ｎ),RＣｔ—Ｎ為血紅素中心尺寸大小,表3為Kｉ和Aｉ測定參數(shù)。1.2fe—Fe-配體振動相關(guān)譜帶在血紅蛋白拉曼光譜中,Fe-配體振動相關(guān)拉曼譜帶出現(xiàn)在400~650cm－１,這一區(qū)段拉曼頻率與連接鐵離子的配體、Fe-配體鍵相關(guān)。Chottard等［１０］對一氧化氮血紅蛋白拉曼光譜的研究認為549cm－１峰歸屬于Fe—NO拉伸振動,該軸振動的拉曼強度來自于卟啉環(huán)Ⅱ電子向Fe—NO部分的離域。Yu等［１１］發(fā)現(xiàn)453,412,500和574cm－１分別歸屬于Fe(Ⅲ)—CN拉伸模式、Fe(Ⅲ)—C—N彎曲振動模式、Fe(Ⅱ)—CO拉伸模式和Fe(Ⅱ)—C—O彎曲振動模式。在Fe—N拉伸振動的研究中,Asher等和Tsubaki等［１２，１３］認為413cm－１處拉曼峰歸屬于Fe—N拉伸振動。Bayden等［７］通過研究紅細胞拉曼光譜發(fā)現(xiàn)567和419cm－１處拉曼峰歸屬于Fe—O２拉伸振動模式和Fe—O—O彎曲振動模式。1.3fe—Fe-His(Fe-近端組氨酸)及蛋白質(zhì)性質(zhì)相關(guān)譜帶Fe—His的共價鍵是血紅素與蛋白質(zhì)亞基連接的唯一橋梁,該鍵的變化影響血紅蛋白的空間結(jié)構(gòu),從而改變血紅蛋白的氧親和力,因此它是區(qū)分R態(tài)(松弛態(tài))和T態(tài)(緊張態(tài))重要的標志峰。Fe—His拉伸模式出現(xiàn)在拉曼光譜低頻區(qū),在脫氧血紅蛋白中,Fe—His拉伸模式出現(xiàn)在200~225cm－１,T態(tài)時Fe—His拉伸模式移至215cm－１附近,R態(tài)時Fe—His拉伸模式移至221cm－１附近［１４］。具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的血紅蛋白拉曼譜帶則出現(xiàn)在高頻區(qū),1630~1670,1240~1267,1003,1446cm－１分別與酰胺Ⅰ、酰胺Ⅲ、苯丙氨酸以及氨基酸側(cè)鏈CH２/CH３變形相關(guān)［７］。2血紅蛋白反應動力學的特征血紅蛋白通過三、四級結(jié)構(gòu)細微變化引起變構(gòu)效應繼而發(fā)揮生物學功能。早期齊變模型及序變模型理論［１５－１７］已初步詮釋了血紅蛋白在R-T轉(zhuǎn)換過程中四級結(jié)構(gòu)的變化,然而血紅蛋白攜/放氧反應的詳細過程及機制尚不清楚。因此,明確血紅素連接與蛋白質(zhì)構(gòu)象變化關(guān)系成為研究血紅蛋白變構(gòu)效應的目標［１８］。近二十年內(nèi),時間分辨光學吸收光譜法、時間分辨圓二色譜、時間分辨磁圓二色譜、時間分辨廣角X射線及時間分辨拉曼光譜等方法進一步闡明了血紅蛋白在R—T轉(zhuǎn)換中三、四級結(jié)構(gòu)內(nèi)部的變化。其中血紅蛋白拉曼光譜可選擇性地監(jiān)測酪氨酸殘基、色氨酸殘基及Fe—His拉伸的振動模式。另外,BandⅠ振動模式(與血紅素環(huán)內(nèi)電子密度相關(guān)的特征譜帶)可以反映卟啉環(huán)和血紅素口袋周圍π電子作用,是協(xié)同效應能量變化的基礎(chǔ),皆有助于揭示血紅蛋白反應動力學具體過程。應用拉曼光譜技術(shù)監(jiān)測血紅蛋白R—T態(tài)轉(zhuǎn)變過程分為Rｄｅｏｘｙ,Rｓ,RＴ,T′幾個階段［１９］。血紅蛋白變化第一步生成中間產(chǎn)物“Rｄｅｏｘｙ”,其拉曼光譜與一個或多個亞基失去配體時拉曼光譜特征相似,但血紅蛋白四級結(jié)構(gòu)仍為R態(tài),色氨酸和酪氨酸相關(guān)譜帶強度降低,推測是由血紅蛋白三級結(jié)構(gòu)中E—A和F—H之間氫鍵斷裂造成的。此時Fe—His鍵松弛或斷裂,但血紅蛋白四級結(jié)構(gòu)還未改變。第二步生成中間產(chǎn)物“Rｓ”,據(jù)推測H和A螺旋移動時可能形成新的氫鍵。第三步生成中間產(chǎn)物“RＴ”,蛋白質(zhì)構(gòu)象開始變化,內(nèi)部二聚體開始旋轉(zhuǎn),α１鏈FG轉(zhuǎn)角與β2鏈C螺旋之間形成“鉸鏈”結(jié)構(gòu)［８］。拉曼光譜顯示了色氨酸β35與精氨酸α94發(fā)生“鏈”式接觸,形成氫鍵。蛋白質(zhì)變化第四步形成中間產(chǎn)物“T′”,此時拉曼光譜反映了α1鏈C螺旋中酪氨酸α42與β2鏈FG轉(zhuǎn)角中精氨酸β99之間形成氫鍵,標志T態(tài)的完全轉(zhuǎn)化［２０，２１］。由于血紅蛋白四個亞基成對重組,仍有配體未與1~2個血紅蛋白亞基分離,因此將其標記為T′。此外,α亞基νＦｅ—Ｈｉｓ拉曼頻率在Rｄｅｏｘｙ,Rｓ,RＴ間基本不發(fā)生變化,T′態(tài)時拉曼頻率迅速降低,而β亞基νＦｅ—Ｈｉｓ拉曼頻率則逐級遞減［２０］。實時監(jiān)測血紅蛋白反應動力學的時間分辨拉曼光譜可獲得這幾個階段反應時間,不同研究組實驗結(jié)果有微小差異(表4)［２２］。這可能與實驗條件、環(huán)境和儀器設備等因素有關(guān)。這些實驗數(shù)據(jù)為闡明血紅蛋白四級結(jié)構(gòu)的變化機制提供了有效依據(jù)。3拉曼光譜法在血液激活功能研究中的應用3.1氧合血紅蛋白特征峰血氧飽和度反映全身氧供需平衡狀態(tài)及組織代謝情況,利用氧合、脫氧過程中血紅蛋白拉曼光譜ν４,ν１０,ν１９特征峰位移的特點,建立體內(nèi)外定量測定血氧飽和度的方法。拉曼光譜中脫氧血紅蛋白ν４,ν１０和ν１９特征峰出現(xiàn)在1360,1605和1555cm－１附近,氧合血紅蛋白ν４,ν１０和ν１９特征峰出現(xiàn)在1375,1640和1585cm－１附近。由此,Torres等［２３］計算ν４,ν１０,ν１９三處特征峰的PR值(peakratios峰比率),即PRｎ=[Iｎｏｘｙ/(Iｎｄｅｏｘｙ+Iｎｏｘｙ)]×100(Iｎｏｘｙ,氧合血紅蛋白在νｎ處拉曼峰強度;Iｄｅｏｘｙ,脫氧血紅蛋白在νｎ處拉曼峰強度),發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外不同濃度血紅蛋白拉曼光譜中PRｎ值與血氧飽和度之間均呈良好的線性相關(guān),證實了拉曼光譜技術(shù)應用于人體組織血氧飽和度無創(chuàng)監(jiān)測的可行性。3.2u3000血紅蛋白拉曼光譜技術(shù)紅細胞內(nèi)血紅蛋白與糖類物質(zhì)(主要是葡萄糖)通過非酶促作用形成糖化血紅蛋白(glycatedhemoglobin,GHb),包括HbA1a1,HbA1a2,HbA1b和HbA1c,其中HbA1c含量最多,與平均血糖波動直接相關(guān)。陽離子交換層析法、電泳法、等電聚焦法、親和層析法、免疫法等現(xiàn)有檢測方法易受各種因素干擾,結(jié)果的準確度、重復性、精密度有待提高［２４］。近兩年研究表明拉曼光譜檢測GHb具有無需添加試劑、靈敏度和精確度高等優(yōu)勢,有望克服現(xiàn)有方法的缺陷［２５，２６］。已有研究采用表面增強拉曼光譜發(fā)現(xiàn)HbA1c相比于HbA在770~830cm－１處特征峰發(fā)生變化［２７］,為建立新型HbA1c檢測技術(shù)提供了新思路。血紅蛋白受惡性瘧原蟲分解代謝為游離血紅素,經(jīng)氧化形成高鐵血紅素(ferriprotoporphyrinIX,FPIX),后者具有細胞毒性。瘧原蟲促進FPIX聚集,形成對自身無害的瘧原蟲色素［２８］。Bayden等發(fā)現(xiàn)了780nm激光下瘧原蟲色素拉曼光譜ν４特征峰(1374cm－１)顯著增強,使拉曼光譜法用于瘧原蟲色素研究成為可能［２９］。隨著抗瘧藥物氯喹的治療,瘧原蟲色素A１ｇ和B１ｇ模式拉曼光譜峰強降低［３０］。針尖增強拉曼光譜增強了探測瘧原蟲色素的靈敏度,便于獲取納米級的分子信息,為抗瘧藥物作用靶點的篩選提供一個新方法［３１］。地中海貧血是由于患者編碼珠蛋白鏈的基因發(fā)生缺陷或缺失,部分珠蛋白鏈無法合成而造成遺傳性溶血性貧血?，F(xiàn)有臨床診斷分析程序繁瑣,診斷周期較長。王桂文等［３２］應用主成分分析法(PCA)分析了地中海貧血紅細胞的拉曼光譜,重型a地中海貧血患者不同紅細胞間的拉曼光譜差異較大,1388,1369,1244,970cm－１等血紅素凝集的標志峰顯著升高,而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的拉曼信號顯著降低。同時,利用反映血紅蛋白氧合/脫氧態(tài)的I１u3000６３８/I１u3000５４７分析了地中海貧血紅細胞和正常紅細胞的攜氧能力,發(fā)現(xiàn)地中海貧血紅細胞的氧親和力增強。這些研究說明血紅蛋白拉曼光譜可成為地中海貧血的診斷工具。血紅蛋白中β鏈第6位谷氨酸被纈氨酸所取代形成了血紅蛋白S(HbS),由其引發(fā)的鐮形細胞病在血紅蛋白病中占有重要地位。當HbS被氧合時,其結(jié)構(gòu)和功能與正常血紅蛋白相似,然而HbS脫氧后經(jīng)歷分子重排過程導致不溶膠形成,使紅細胞扭曲成鐮形變異體?；贖bS結(jié)構(gòu)的藥物設計需要獲得多聚體最佳斷裂位點,又由于拉曼光譜可提供血紅蛋白三、四級結(jié)構(gòu)變化的具體信息［３３］,因此運用拉曼光譜技術(shù)可以監(jiān)測HbS不溶膠形成過程中血紅蛋白分子間鹽鍵形成、氫鍵連接、非極性和疏水結(jié)構(gòu)域等［３４－３６］變化,以便進行靶向藥物的篩選。4影響測量結(jié)果的因素拉曼散射信號較弱,并且是絕對測量得到的。激光波長、激光功率、曝光時間、樣品溫度、聚焦光斑的大小及浸沒深度等因素皆會增加測量誤差,影響測量結(jié)果的穩(wěn)定性?？刂朴绊懷t蛋白拉曼光譜測量的因素有望提供一個穩(wěn)定的檢測環(huán)境,提高分析測試的準確性和重復性,下面將逐一進行討論。4.1白拉曼光譜檢測血紅蛋白中生色團由于血紅蛋白在α,β和Soret帶有特征吸收,當激光頻率位于上述吸收帶內(nèi),拉曼光譜中100~1700cm－１之間拉曼峰增強,發(fā)生共振拉曼效應,可提高檢測靈敏度［３７］。不同激光波長血紅蛋白拉曼光譜峰可選擇性增強血紅蛋白中生色團的振動模式。Sato等［３７］發(fā)現(xiàn)514.5nm波長激光下血紅蛋白特征表現(xiàn)受到較大干擾,720nm波長激光下拉曼光譜主要表現(xiàn)血紅素結(jié)構(gòu)特點,1064nm波長激光下拉曼光譜主要表現(xiàn)血紅素和蛋白質(zhì)的特征。Bayden等研究了632.8,780,1064nm波長激光下HbS的拉曼光譜及488,514,568,633,785nm波長激光下紅細胞的拉曼光譜,推測較低波長(如488,514,568和633nm)激光下,拉曼光譜以血紅素的共振增強效應為主,較高波長(如780,785和1064nm)激光下,蛋白質(zhì)譜帶特征開始出現(xiàn)［７］。4.2功率激光對血紅素的影響激光功率越大,拉曼信號越強,但易引起血紅蛋白變性;激光功率小,雖避免了血紅蛋白變性但拉曼光譜信噪比降低。Bayden等［７］發(fā)現(xiàn)24mW功率激光會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性導致血紅素聚集,而18mW功率激光下拉曼光譜信噪比最高。本課題組研究了激光功率范圍在0.1~100mW之間的牛血紅蛋白顯微共焦拉曼光譜,功率升高拉曼光譜信噪比增強,但激光功率大于50mW時拉曼光譜基線會發(fā)生變化,提示血紅蛋白可能發(fā)生了變性。4.3光斑浸沒的影響當采用顯微拉曼光譜研究血紅蛋白時,聚焦光斑的大小及光斑浸入樣品的浸沒深度對實驗結(jié)果也有顯著的影響。聚焦光斑小,單位體積樣品獲得能量大,高能量密度能會使紅細胞溶血,從而改變血紅蛋白化學鍵,引起光解離效應;聚焦光斑大,單位體積樣品獲得能量小,不易受激光灼燒。而光斑浸沒深度的影響與樣品的透明度有關(guān)。血紅蛋白樣品的透明度往往較低,浸沒深度較大時,樣品對激光的吸收及散射較大,導致拉曼信號信噪比降低［２３］。這一效應也與激光波長有關(guān),波長較長的激光受浸沒深度的影響較小。發(fā)現(xiàn)514.5和785nm激光下,0,50,100,200μm四個光斑深度得到的血紅蛋白拉曼峰頻率基本相同,但514.5nm激光下的拉曼峰強度隨光斑深度增大而降低,785nm激光下光斑深度變化對拉曼峰強度影響不大,但低光斑深度會造成樣品局部受激光灼傷變性。4.4長激光下人紅細胞的生長曝光時間短,血紅蛋白不易變性但信號弱;曝光時間長,易引起蛋白質(zhì)變性。Dasgupta等［３８］觀察近紅外波長激光下人紅細胞拉曼光譜,發(fā)現(xiàn)長時間曝露在激光下會使蛋白質(zhì)變性、高鐵血紅素形成以及細胞內(nèi)血紅素聚集。Bayden等［７］發(fā)現(xiàn)延長曝光時間,1639,1620,1547,1566,1547,1212,1003和755cm－１處特征峰強度降低。其中1639cm－１處拉曼強度降低說明延長曝光時間會導致樣品氧化。4.5血紅蛋白濃度拉曼強度隨著血紅蛋白濃度升高而增強,但過高濃度的血紅蛋白溶液導致激發(fā)光穿透力下降。Spiro等［３］認為要得到高信噪比的拉曼光譜,血紅蛋白濃度應控制在10－３~10－５mol·L－１之間。溫度會影響拉曼峰高度、寬度、退偏振率和累積面積。Cho,Tsubaki,Ondrias等［１３，３９，４０］均考察