《禽蛋中卵黃免疫球蛋白的測定高效液相色譜法》編制說明

中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準禽蛋中卵黃免疫球蛋白的測定高效液相色譜法（征求意見稿）編制說明《禽蛋中卵黃免疫球蛋白的測定高效液相色譜法》編制小組2023年10月《禽蛋中卵黃免疫球蛋白的測定高效液相色譜法》編制說明工作簡況，包括任務來源、制定背景、起草過程等（一）任務來源本標準根據(jù)2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管司下達工作任務安排，項目下達文件號農(nóng)質(zhì)標函[2020]128號，項目計劃號農(nóng)質(zhì)標函[2020]128號202065，在參考國內(nèi)外有關免疫球蛋白測試分析方法的基礎上結(jié)合前期研究基礎及我國生產(chǎn)檢驗中的實際情況，由XXXX作為本標準負責起草單位，XXX教授為項目的首席專家。（二）制定背景1、測定禽蛋卵黃免疫球蛋白IgY的意義國際上從上世紀70年代就開始研究從牛奶、乳清、初乳和血液中提取免疫球蛋白G（IgG）的技術和工藝，但由于資源不足，免疫球蛋白資源的開發(fā)一直沒有重大的進展。禽蛋蛋黃中的免疫球蛋白Y（ImmunoglobulinofYolk,IgY）由于在被動免疫治療中獨特優(yōu)勢，逐漸被關注和研究。IgY是禽類通過免疫系統(tǒng)自然生產(chǎn)的抗體，蓄積于禽蛋蛋黃中，來源天然健康；其通過免疫反應產(chǎn)生的特異性IgY抗體能針對特定病原體的多個抗原表位，不會引起病原微生物的特異性抗性，也不會影響宿主體內(nèi)微生物菌群的架構；從生物學角度來講，人與禽的親緣關系較遠，存在人和禽共患疾病的機率也較小，因此，與同種屬或相近動物的IgG相比，IgY有更好的特異性和敏感性。與哺乳動物的IgG相比，IgY具有更好的局部活性和更強的抗原結(jié)合力。禽蛋中IgY的含量與禽蛋類別、飼料組成、蛋禽日齡有一定的關系。近幾十年，各國學者開始研究從禽蛋卵黃中分離純化IgY，禽蛋成為提取免疫球蛋白的最佳資源，母禽被稱為高效率、高質(zhì)量的抗體生產(chǎn)廠。IgY提取技術已被公認為是從哺乳動物血液中獲取抗體的最佳替代手段，然而，該技術至今未能獲得大規(guī)模的推廣和應用，其主要原因在于IgY的分離純化以及定量分析較為困難，缺乏可依據(jù)的標準。2、禽蛋中卵黃免疫球蛋白IgY提取富集的方法卵黃中水分約占48%，蛋白質(zhì)約占18%，脂類約占30%，其中大部分脂肪與蛋白質(zhì)以脂蛋白的形式存在。IgY是存在于蛋黃中的水溶性蛋白質(zhì)，其總量僅為蛋黃固形物的10%。實現(xiàn)IgY的富集必須去除大部分的低密度脂蛋白。傳統(tǒng)方法通過水稀釋、有機溶劑、非離子型表面活性劑等方法凈化基質(zhì)，分離卵黃中的脂類和免疫球蛋白。不同的前處理方式，禽蛋IgY的檢測結(jié)果有一定的差異。并且不同的禽蛋品種，不同的蛋齡甚至飼料都會引起IgY的含量差異。因此，目前急需要建立一種簡單高效的禽蛋蛋黃前處理方法，為進一步的IgY分析測試奠定基礎。水稀釋法是1992年首次提出用于蛋黃液中親水性和疏水性組分的分離。即將蛋黃液加水稀釋一定倍數(shù)，調(diào)節(jié)溶液pH值，混勻靜置后離心分離，根據(jù)脂蛋白不溶于水這一特性，使脂蛋白聚集沉淀，獲得含IgY的上清液。對水稀釋法進一步進行技術優(yōu)化，可以達到分離步驟簡單、快速、脫脂效率高，實現(xiàn)綠色環(huán)保，低成本的分離富集卵黃免疫球蛋白。3、卵黃免疫球蛋白IgY的分析方法IgY與IgG在結(jié)構與性質(zhì)上都有一定的差異，IgG主要來源于動物的血清，而IgY主要來源于禽蛋黃。我國尚缺少針對禽蛋中IgY的定量檢測的分析方法。目前國內(nèi)只有針對保健食品、飼料、乳制品中IgG的檢測標準方法，結(jié)果見表1。表1免疫球蛋白的測定方法標準名稱標準名稱方法狀態(tài)1保健食品中免疫球蛋白IgG的測定GB/T5009.194-2003親和色譜-UV有效2飼料中免疫球蛋白IgG的測定高效液相色譜法GB/T21033-2007親和色譜-UV有效3牛初乳及其制品中免疫球蛋白IgG的測定分光光度法NY/T2070-2011分光光度法有效4出口牛乳制品中牛免疫球蛋白G的測定酶聯(lián)免疫吸附法SN/T3132-2012酶聯(lián)免疫吸附法有效5牙膏中蛋黃球蛋白（IgY）活性效價測定方法QB/T4363-2012酶聯(lián)免疫吸附法有效6奶及奶制品中免疫球蛋白IgG的測定高效液相色譜法T/TDSTIA003-2021液相色譜法有效7乳及乳制品中免疫球蛋白IgG的測定（高效液相色譜法）T/SSFS0002-2021液相色譜法有效由表可知GB/T5009.194-2003保健食品中免疫球蛋白IgG的測定，采用免疫親和色譜，利用Hi-TrapproteinG色譜柱進行IgG的特異性吸附和純化，紫外作為檢測器。GB/T21033-2007，使用同樣的方法測定飼料和含IgG的飼料原料中的IgG含量，該方法最低檢出限為5μg/g。NY/T2070-2011測定牛初乳及其制品中免疫球蛋白IgG含量，該標準提供了IgG的紫外分光光度定量分析方法，方法簡單，試劑常見，成本低廉，然而該方法只適用于基質(zhì)簡單的體系和IgG含量大于0.2mg/mL的牛初乳及其制品中IgG的測定，對IgG含量較低的的樣品無法進行定量分析。SN/T3132-2012出口牛乳制品中牛免疫球蛋白G的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法對牛乳制品中免疫球蛋白含量進行了分析，但是該方法操作步驟繁瑣，耗費時間比較長，回收率并不理想，且使用的試劑較為昂貴。T/TDSTIA003-2021奶及奶制品中免疫球蛋白IgG的測定高效液相色譜法、T/SSFS0002-2021乳及乳制品中免疫球蛋白IgG的測定（高效液相色譜法）近幾年的行業(yè)協(xié)會組織制定的行業(yè)標準逐漸開始采用更加簡潔高效，易于操作實現(xiàn)的液相色譜法進行乳制品中免疫球蛋白IgG的測定，具有靈敏快速的特點。由于禽蛋蛋黃中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量高，脂蛋白、脂質(zhì)、小分子物質(zhì)與水溶性IgY共存，形成均一的乳化體系，樣品背景基質(zhì)比較復雜，分離純化有一定難度。如果采用較復雜精細的前處理純化步驟，又勢必引起IgY的損失。因此，本標準建立了一種簡潔有效的前處理技術，結(jié)合液相色譜高效分離與高靈敏的快速檢測，實現(xiàn)對禽蛋蛋黃中IgY的定量分析。結(jié)合本團隊十幾年的研究經(jīng)驗，我們研究發(fā)現(xiàn)了一種簡單高效的蛋黃前處理技術，利用純水作為分離介質(zhì)，實現(xiàn)水溶性IgY與非水溶性組分的分離，采用超聲分散技術加快相分離。調(diào)節(jié)組分pH值分離沉淀水溶性的脂蛋白，優(yōu)化了相分離的溫度與時間，使基質(zhì)的脫脂率達到99%以上，IgY的富集效率大大提高。經(jīng)離心分離、脂質(zhì)凈化和過濾膜后，可直接上樣分析。在色譜分析方法的選擇上，親和層析色譜分離效果較好，廣泛應用于IgG檢測，但是操作繁瑣，分析時間較長，并且不適合批量測試。本標準沒有采用目前主流的親和柱進行分離富集的原因是目前市面上常用的親和層析填料是免疫球蛋白結(jié)合蛋白A和蛋白G，通過與Fc域結(jié)合來純化抗體IgA和IgG。但是，由于氨基酸序列和構象的差異，這兩種結(jié)合蛋白對卵黃免疫球蛋白IgY沒有親和力。針對IgY的特異性配基填料研發(fā)較少，柱成本非常昂貴而且性能不穩(wěn)定。在結(jié)合本團隊十多年的研究基礎上，經(jīng)過試驗分析，我們發(fā)現(xiàn)水稀釋法樣品前處理結(jié)合尺寸排阻色譜對IgY的分離效果非常理想，結(jié)合紫外，可實現(xiàn)快速靈敏對禽蛋中IgY含量進行定量檢測，具有檢測速度快，靈敏度高特點，并且實驗操作簡單，所用試劑耗量小、成本低，易于批量生產(chǎn)。（三）起草過程1、起草階段2019年7月，項目下達后，按照項目任務書的要求，我們積極組織人員成立標準編制工作小組。標準的編制組成員包括項目承擔單位XXXX標準化制定人員，同時吸收了XXXX等相關標準編制人員，負責標準的信息調(diào)研與收集、整理和編制工作。具體人員分工見表2。表2主要參與人員任務分工表2020年7月-9月，標準編制小組查閱了大量文獻，根據(jù)本團隊前期研究基礎，針對禽蛋中卵黃免疫球蛋白IgY的提取和檢測條件作了優(yōu)化，并測定了蛋黃中IgY的工作曲線、精密度與回收率，形成標準初稿。根據(jù)所搜集到的資料以及實驗結(jié)果，在科學、先進、實用的原則下，標準編制小組根據(jù)這些結(jié)果起草了標準草案。標準編制組起草人員經(jīng)共同研究，根據(jù)討論的意見，撰寫了標準征求意見稿。2020年9月-10月，選定XXXX對初步形成的禽蛋中IgY的測定-液相色譜法進行驗證，確定相關指標參數(shù)，起草小組對標準文本和編制說明進行多次修改，形成征求意見稿。2、定向征求意見2020年11月，標準編制組定向在行業(yè)內(nèi)組織征求意見工作，包括食品檢測管理部門、蛋品加工企業(yè)，檢測機構以及高校等多家機構，截至2020年12月，共征集29個單位的意見，其中檢測機構21家，企業(yè)5家，高校3家，收回22個單位的有效建議75條。征求意見主要人員見表3。標準編制組對所征集的建議進行了慎重的考慮和分析，采納61條，部分采納1條，不采納13條。根據(jù)反饋的意見和建議，標準編制小組對標準草案做了適當修改，形成標準征求意見稿。根據(jù)反饋的意見進行了修改，形成標準預審稿。表3定向征求意見的單位及個人信息匯總表類別序號姓名單位職稱（務）研究所1彭毛武漢市糧油食品中心檢驗站工程師高校2何瑜湖北大學副教授研究所3鐘書華鄂州市環(huán)境保護檢測站工程師高校4沈曉芳江南大學教授高校5劉麗莉河南科技大學教授高校6耿放成都大學教授企業(yè)7許太基譜尼測試集團深圳有限公司實驗室經(jīng)理/工程師研究所8盧體康深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心中心主任/高級獸醫(yī)師研究所9吳鳳琪深圳海關食品檢驗檢疫技術中心獸藥殘留科科長/高級工程師研究所10鄧夢雅深圳市計量質(zhì)量檢測研究院檢驗員/工程師企業(yè)11姜學涯深圳凱吉星農(nóng)產(chǎn)品檢測認證有限公司副總監(jiān)/工程師企業(yè)12張巖深圳中檢聯(lián)檢測有限公司實驗室有機主管/工程師研究所13周芳梅廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗站副站長/高級工程師研究所14伍宏凱廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心科長/獸醫(yī)師研究所15沈詳廣農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（廣州）檢測室主任/高級獸醫(yī)師企業(yè)16劉磊深圳三方圓檢測監(jiān)管服務有限公司分析檢測部經(jīng)理/高級工程師企業(yè)17謝冬霞深圳三方圓檢測監(jiān)管服務有限公司副總經(jīng)理/工程師研究所18姜杰深圳市疾病預防控制中心理化檢測所副所長/正高級主任技師企業(yè)19陳煒光深圳市綠詩源生物技術有限公司區(qū)域總經(jīng)理/工程師3、預審階段2023年3月16日，XXXX組織專家對XXXX等單位起草的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《禽蛋中卵黃免疫球蛋白的測定高效液相色譜法》（預審稿）進行了認真審查。專家組由曾勇、張莉、李會榮、夏虹、彭大鵬、陳世楨、李婷婷組成。在聽取起草專家匯報的基礎上，專家組審查了標準文本及編制說明，專家一致審查通過，并提出如下修改意見：①進一步完善編制說明，補充線性范圍，雞蛋、鴨蛋、鴿蛋、鵪鶉蛋的空白、定量限、添加回收等數(shù)據(jù)和圖譜。②驗證報告補充線性范圍、檢出限、定量限、不同基質(zhì)中添加回收等數(shù)據(jù)和圖譜。③補充完善色譜柱、波長、離心速度及時間的優(yōu)化數(shù)據(jù)。④按GB/T1.1-2020和GB/T20001.4-2015的要求進一步規(guī)范標準文本。專家意見匯總處理表見附件。4、公開征求意見階段。2023年4月-7月，根據(jù)預審稿專家意見，標準編制小組根據(jù)本團隊前期研究基礎，針對禽蛋中卵黃免疫球蛋白IgY的提取和檢測條件繼續(xù)作了優(yōu)化，并擴充了不同的基質(zhì)的檢驗情況，同時增大了抽樣選取的范圍以及批次，根據(jù)優(yōu)化條件，重新測定了蛋黃中IgY的工作曲線、精密度與回收率，修改了標準文稿，并重新選定農(nóng)業(yè)農(nóng)村部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心（揚州）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（廣州）、譜尼測試集團深圳有限公司等三家檢驗機構對不同基質(zhì)的禽蛋中IgY的液相色譜法測定進行了驗證，三家驗證報告覆蓋了雞蛋、鵪鶉蛋、鴿子蛋、鵝蛋、鴨蛋等市面上常見禽蛋基質(zhì)，確定相關指標參數(shù)，形成修改后的驗證報告以及編制說明。2023年8月，編制小組按照預審專家提出的修改意見對標準材料進行進一步的完善，形成了公開征求意見稿。國家標準編制原則、主要內(nèi)容及其確定依據(jù)，修訂國家標準時，還包括修訂前后技術內(nèi)容的對比（一）標準的編寫原則本標準制定遵循“先進性、實用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性”的總原則，注重標準的通用性、適用性、先進性和可操作性。本標準制定以簡化卵黃免疫球蛋白的提取程序，節(jié)約時間、提高效率和提高測試方法的準確度、精密度、檢測限和定量限為基本原則，嚴格按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構和起草規(guī)則》和GB/T20001.4-2015《標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準》的要求進行制定。本標準制定過程中力求做到技術內(nèi)容的敘述正確無誤，文字表達準確、簡明、易懂；標準的構成嚴謹合理，內(nèi)容編排、層次劃分符合邏輯與規(guī)定。（二）主要技術內(nèi)容確定依據(jù)1、樣品基質(zhì)的選擇為了充分比較不同禽蛋中免疫球蛋白IgY的含量，分別采集了雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鵪鶉蛋、鴿子蛋樣品作為檢測基質(zhì)和驗證材料樣品基質(zhì)。2、樣品提取凈化條件的確定卵黃中水分約占48%，蛋白質(zhì)約占18%，脂類約占30%，其中大部分脂肪與蛋白質(zhì)以脂蛋白的形式存在。IgY是存在于蛋黃中的水溶性蛋白質(zhì)，其總量僅為蛋黃固形物的10%。實現(xiàn)IgY的富集必須去除大部分的低密度脂蛋白。傳統(tǒng)方法通過水稀釋、有機溶劑、非離子型表面活性劑等方法凈化基質(zhì)，分離卵黃中的脂類和免疫球蛋白。不同的前處理方式，禽蛋IgY的檢測結(jié)果有一定的差異。并且不同的禽蛋品種，不同的蛋齡甚至飼料都會引起IgY的含量差異。因此，目前急需要建立一種簡單高效的禽蛋蛋黃前處理方法，為進一步的IgY分析測試奠定基礎。水稀釋法是一種利用水分離蛋黃液中親水性和疏水性組分的方法。即將蛋黃液加水稀釋一定倍數(shù)，調(diào)節(jié)溶液pH值，混勻靜置后離心分離，根據(jù)脂蛋白不溶于水這一特性，使脂蛋白聚集沉淀，獲得含IgY的上清液。對水稀釋法進一步進行技術優(yōu)化，可以達到(1)分離步驟簡單、快速，脫脂效率高；(2)使用水作為綠色環(huán)保，成本低；(3)不添加化學試劑，不損害IgY活性，安全性高。本凈化過程即采用水稀釋法，并在此基礎上進行了改良優(yōu)化，過程如圖1所示，優(yōu)化了水稀釋倍數(shù)、pH、靜置時間、離心轉(zhuǎn)速以及溶劑凈化等條件。圖SEQ圖\*ARABIC1IgY前處理技術路線稀釋倍數(shù)優(yōu)化雞蛋稀釋倍數(shù)根據(jù)脂蛋白不溶于水的特性，將蛋黃溶于水，使脂蛋白聚集沉淀，獲得含IgY的上清液。從試驗結(jié)果看出，隨稀釋倍數(shù)的增加，蛋白質(zhì)濃度逐漸減少，透光率和除脂率逐漸增加，上清液變得更澄清，透光率在稀釋10倍后無顯著變化。特別是，當稀釋倍數(shù)從4到5倍時上清液中脂肪含量迅速減少，透光率變化非常顯著，當稀釋倍數(shù)達到8倍以上時，除脂率達到99%以上。電泳結(jié)果顯示當稀釋倍數(shù)較低時，蛋白質(zhì)組分中有較多雜蛋白，而隨著稀釋倍數(shù)升高，上清液中雜蛋白逐漸消失。綜合以上結(jié)果，稀釋10倍是分離雞蛋中IgY的最適條件。圖SEQ圖\*ARABIC2稀釋倍數(shù)對雞蛋IgY提取液蛋白濃度（A）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS（D）的影響（4-12分別表示稀釋倍數(shù)）鵪鶉蛋稀釋倍數(shù)圖SEQ圖\*ARABIC3稀釋倍數(shù)對鵪鶉蛋IgY提取液蛋白濃度（A）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS（D）的影響（4-12分別表示稀釋倍數(shù)）從試驗結(jié)果看出，隨稀釋倍數(shù)的增加，蛋白質(zhì)濃度逐漸減少，透光率和除脂率逐漸增加，上清液變得更澄清，特別是稀釋倍數(shù)從6到8倍時，變化非常的顯著。稀釋倍數(shù)8倍以上，除脂率能達到99%以上。通過電泳條帶也可清晰看到，IgY在250kDa附近的條帶較清晰，稀釋倍數(shù)8倍以上時可達到較好的分離效果。鵝蛋稀釋倍數(shù)從試驗結(jié)果看出，隨稀釋倍數(shù)的增加，蛋白質(zhì)濃度逐漸減少，透光率和除脂率逐漸增加，上清液變得更澄清，特別是稀釋倍數(shù)從6到8倍時，變化非常的顯著。稀釋倍數(shù)10倍以上，除脂率能達到99%以上。通過電泳條帶也可清晰看到，隨著稀釋倍數(shù)升高，上清液中雜蛋白條帶逐漸消失，IgY在250kDa附近的條帶也越清晰，稀釋倍數(shù)10倍以上時可達到較好的分離效果。圖SEQ圖\*ARABIC4稀釋倍數(shù)對鵝蛋IgY提取液蛋白濃度（A）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS（D）的影響（4-12分別表示稀釋倍數(shù)）鴿子蛋稀釋倍數(shù)從試驗結(jié)果看出，隨稀釋倍數(shù)的增加，蛋白質(zhì)濃度逐漸減少，透光率和除脂率逐漸增加，上清液變得更澄清。稀釋倍數(shù)10倍以上，除脂率能達到98.8%以上。通過電泳條帶也可清晰看到，隨著稀釋倍數(shù)升高，上清液中雜蛋白條帶逐漸消失，IgY在250kDa附近的條帶也越清晰，稀釋倍數(shù)10倍以上時可達到較好的分離效果。圖SEQ圖\*ARABIC5稀釋倍數(shù)對鴿子蛋IgY提取液蛋白濃度（A）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS（D）的影響（4-12分別表示稀釋倍數(shù)）鴨蛋稀釋倍數(shù)圖SEQ圖\*ARABIC6稀釋倍數(shù)對鴨蛋IgY提取液蛋白濃度（A）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS（D）的影響（6-14分別表示稀釋倍數(shù)）從試驗結(jié)果看出，隨稀釋倍數(shù)的增加，蛋白質(zhì)濃度逐漸減少，透光率和除脂率逐漸增加，上清液變得更澄清，特別是稀釋倍數(shù)從8到10倍時，透光率變化非常的顯著。稀釋倍數(shù)10倍以上，除脂率能達到99%以上。通過電泳條帶也可清晰看到，隨著稀釋倍數(shù)升高，上清液中雜蛋白條帶逐漸消失，稀釋10倍時，IgY在250kDa附近的條帶較清晰。綜合上述不同品種禽蛋的稀釋倍數(shù)的條件考察，最終選擇采用10倍的稀釋率。以免疫球蛋白含量最低的鴨蛋作為基質(zhì)，采用10倍的水稀釋率，進一步優(yōu)化后續(xù)前處理步驟。pH優(yōu)化有研究表明，蛋白質(zhì)之間的相互作用和聚合行為受pH值影響較大，水稀釋法提取IgY時，調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)的等電點5.0~5.4附近可以增強雜質(zhì)蛋白的沉降，從而獲得純度更高的IgY水溶液。由圖可知，pH值在5.0~5.4之間時水溶性組分中蛋白濃度較低，有利于雜蛋白的沉降，并且透光率較高，除脂率可達99%以上。SDS結(jié)果顯示在pH5.0~5.4時雜蛋白條帶較淺。綜合以上結(jié)果表明，pH5.0~5.4是分離IgY的最適條件。圖SEQ圖\*ARABIC7pH對鴨蛋IgY提取液蛋白濃度（A）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS（D）的影響（1-8分別表示不同pH4.6，4.8，5.0，5.2，5.4，5.6，5.8，6.0）靜置時間優(yōu)化蛋白質(zhì)與酸作用需要一定時間。從試驗結(jié)果看出，靜置時間從4到6h時，蛋白濃度、透光率、除脂率變化最大，延長靜置時間，變化較緩慢；除脂率在靜置6h以上基本不變，能達到99%以上。通過電泳條帶也可清晰看到，靜置時間6h以上時，IgY在250kDa附近的條帶較清晰，雜蛋白條帶較淺。圖SEQ圖\*ARABIC8靜置時間對鴨蛋IgY提取液蛋白濃度（A）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS（D）的影響（4-12分別表示靜置時間）離心轉(zhuǎn)速優(yōu)化圖SEQ圖\*ARABIC9離心轉(zhuǎn)速對鴨蛋IgY提取液蛋白濃度（A）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS（D）的影響（1-5分別表示離心轉(zhuǎn)速5000、5500、6000、6500、7000r/min）離心力的變化對蛋黃顆粒的去除有一定影響，離心力越大，沉淀的蛋黃顆粒越多，而當離心力增加到一定程度時，蛋黃顆粒的沉淀量會達到峰值。從試驗結(jié)果看出，離心轉(zhuǎn)速對蛋白濃度影響不大；透光率在離心轉(zhuǎn)速6000r/min以上基本不變；除脂率在離心轉(zhuǎn)速6000r/min以上基本不變，能達到99%以上。通過電泳條帶也可清晰看到，離心轉(zhuǎn)速6000r/min以上時，IgY在250kDa附近的條帶較清晰，雜蛋白條帶較淺。溶劑凈化優(yōu)化進一步優(yōu)化不同濃度鹽溶處理和正己烷兩種方式凈化樣品溶液。從試驗結(jié)果看出，正己烷處理效果比鹽溶處理效果更好。在蛋白質(zhì)水溶液中，加入少量的中性鹽，會增加蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。從實驗結(jié)果看出，在5ml上清液中加入少量NaCl，溶液的透光率會增大。當加入0.06gNaCl（0.21mol/L）時，溶液的透光率最大，從宏觀圖也可看出此時溶液最澄清。正己烷能夠凈化水溶液中的脂質(zhì)。從實驗結(jié)果看出，加入正己烷(>1:5V:V)顯著提高了樣品溶液的透光率，溶液變得更澄清，各組別之間無明顯差異。圖SEQ圖\*ARABIC10對鴨蛋IgY提取液進行鹽溶處理和正己烷處理優(yōu)化。鹽溶處理優(yōu)化：透光率（A），宏觀圖（B）；正己烷處理優(yōu)化：透光率（C），宏觀圖（D）經(jīng)過優(yōu)化后的具體方法如下：在同一批次中取6個~10個禽蛋樣品，鴿蛋、鵪鶉蛋可適當增加樣品數(shù)量。洗凈去殼，分離蛋清蛋黃，將蛋黃置于濾紙上輕輕滾動吸去蛋黃膜上附著的蛋清，用鑷子刺破蛋黃膜將蛋黃液收集于燒杯中，攪拌均勻后裝入聚乙烯瓶中，作為待測試樣，于4℃條件下保存。在充分比較了水稀釋倍數(shù)、pH、靜置時間、離心轉(zhuǎn)速以及溶劑凈化對IgY的提取效果的影響。并綜合考慮實際操作情況，最終選擇，按照質(zhì)量比1:10以上的稀釋率，調(diào)節(jié)pH為5.00±0.05，超聲，4℃下冷藏靜置12h，并6000r/min離心20min，取上清液用正己烷進一步凈化后作為IgY的最佳分離提取條件。具體方法如下：準確稱取試樣2.00g（精確至0.01g）于25.0mL比色管中，加入純水稀釋并定容至25mL，振搖混勻后，用1.00mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.00±0.05。冰浴條件下超聲30min，0℃~4℃冷藏靜置12h，離心（0℃~4℃，6000r/min）20min，收集上清液，上清液中加入5.00mL正己烷，振搖混勻后，離心（0℃~4℃，6000r/min）20min，棄去上層正己烷，取1mL~2mL溶液過0.22μm濾膜，所得濾液供高效液相色譜檢測分析用。3、色譜條件的優(yōu)化（1）檢測波長的確定IgY作為一種大分子球蛋白，在紫外波長范圍內(nèi)，于200nm與280nm處均有吸收波長。由圖11可知，波長為280nm時所出的色譜法峰峰型尖銳、峰寬較窄，分離效率更高，因此本文件起草小組最終選擇280nm作為檢測波長。ab圖SEQ圖\*ARABIC11標準曲線色譜圖（a:λ=200nm;b:λ=280nm）ab（2）色譜柱的選擇蛋白A和G通常用作免疫球蛋白結(jié)合蛋白（IBPS），通過與Fc域結(jié)合來純化抗體，例如IgG和IgA。但是，由于氨基酸序列和構象的差異，IBPS對卵黃免疫球蛋白IgY沒有親和力，市面上針對IgY的特異性配基填料研發(fā)較少，柱成本非常昂貴而且性能不穩(wěn)定。尺寸排阻色譜作為凝膠色譜的一種形式，是利用填料中固定相的孔隙來限制溶劑和溶質(zhì)分子的進入，從而實現(xiàn)對分子的分離。在尺寸排阻色譜中，較大的分子能夠順利通過更大的孔隙，流速較快；而較小的分子則受到孔隙的限制，流速較慢。通過分子的不同大小，尺寸排阻色譜可以用于分離蛋白質(zhì)、聚合物、核酸等。結(jié)合本課題組前期工作中對雞蛋卵黃免疫球蛋白含量的測定方法，篩選出TosohTSKgelSW3000xl、BIoCoreSEC-300S、AdvanceBioSEC300A三種凝膠滲透色譜柱來進行實驗比較，IgY標準物質(zhì)的出峰情況見圖12。由圖可知，AdvanceBioSEC300A柱所出圖譜基線平整，分離度、峰形較好，沒有明顯拖尾，最終選擇AdvanceBioSEC300A作為本項目檢測用色譜柱。ababc圖SEQ圖\*ARABIC12不同色譜柱分離的標準物色譜圖（a:TosohTSKgelSW3000xl;b:BIoCoreSEC-300S;c:AdvanceBioSEC300A）（3）流動相和洗脫程序的選擇本實驗在閱讀大量文獻的基礎上，采用優(yōu)化后的前處理方法處理樣品，在實際樣品的檢測中，使用AdvanceBioSEC300A色譜柱推薦流動相磷酸鹽緩沖溶液作為流動相進行樣品的分離，但如圖13-a所示，只使用磷酸鹽緩沖溶液時雞蛋實際樣品所出峰形較差，于是在流動相中引入有機相進行等度洗脫，如圖13-b、13-c所示，加入有機相后，雞蛋實際樣品的峰形得到大幅度改善，分離度上升，峰形尖銳。aabcc圖SEQ圖\*ARABIC13雞蛋實際樣品不同流動相色譜圖（a.磷酸鹽緩沖溶液、b.磷酸鹽緩沖溶液+1%異丙醇、c.80%磷酸鹽緩沖溶液+20%乙腈）流動相中加入有機相能夠大幅度改善色譜峰的峰形，鴨蛋基質(zhì)在本實驗中所用基質(zhì)中峰形表現(xiàn)最差，故在AdvanceBioSEC300A色譜柱的承受范圍之內(nèi)加入不同濃度的乙腈添加量探究其對峰形的影響。如圖14所示，隨著乙腈量的增大，鴨蛋基質(zhì)的出峰情況得到明顯改善，考慮到凝膠色譜柱的對有機相的耐受度，最后采用20%乙腈+80%磷酸鹽緩沖溶液作為流動相。aabcd圖SEQ圖\*ARABIC14鴨蛋實際樣品不同流動相色譜圖（a.磷酸鹽緩沖溶液、b.90%磷酸鹽緩沖溶液+10%乙腈、c.85%磷酸鹽緩沖溶液+15%乙腈、d.80%磷酸鹽緩沖溶液+20%乙腈）在流動相中加入Na2SO4有助于優(yōu)化鹽離子強度，加強IgY的分離，促進分析信號的增強。本實驗探究加入不同濃度的Na2SO4，對測定結(jié)果的影響，實驗結(jié)果見表4。表44.00mg/mL的標準溶液在不同離子強度洗脫結(jié)果（流速0.8mL/min）Na2SO4濃度（mol/L）0.050.10.2洗脫時間（min）252525保留時間（min）8.1088.0798.121峰面積（mAU*s）496850624920峰高246.7247.5246.3由表4可知，4.00mg/mL的標準溶液含有0.1mol/LNa2SO4的磷酸鹽緩沖液條件下響應較高，故選擇含有0.1mol/LNa2SO4的磷酸鹽緩沖液進行流速測試實驗，測定結(jié)果見表5。表52.00mg/mL的標準溶液不同緩沖液流速洗脫結(jié)果（0.1mol/LNa2SO4）緩沖液流速（mL/min）0.60.81.0洗脫時間（min）252525保留時間（min）11.4358.1056.656峰面積峰面積（mAU*s）375425911921峰高180.8134.492.5柱壓（bar）97.6130.2171.6由表5可知，當流速為0.8mL/min時，柱壓為130.2bar，AdvanceBioSEC300A色譜柱推薦柱壓137bar，最終選擇含有0.1mol/LNa2SO4的80%磷酸鹽緩沖液+20%乙腈為流動相，0.8mL/min流速，等度洗脫。（4）繪制標準曲線在本測定標準中，準確稱取0.500gIgY標準物質(zhì)（純度>97%，稱取精確至0.0001g），用流動相（0.1mol/LNa2SO4磷酸鹽緩沖液（pH6.6））溶解并定容至25.0mL，搖勻，配制成20.0mg/mL標準儲備液，于-18℃條件下避光保存?zhèn)溆?，可使?個月，用標準儲備液稀釋后立即配置、1個月后配置、2月后配置分別進行上樣測試，測試結(jié)果見表6，色譜圖見圖15。由圖表可知，用標準儲備液稀釋配置的2.00mg/mL的標準溶液其峰面積當日配置與一個月后配置之間沒有太大的區(qū)別，2個月后配置峰面積略有下降，故本研究將儲備液的儲存時間定為1個月。表62.00mg/mL標準溶液峰面積數(shù)據(jù)配置時間當日1個月2個月峰面積/mAU*s2704.031982734.350592619.63696cbacba圖SEQ圖\*ARABIC152.00mg/mL標準溶液色譜圖（a.當日配置、b.1個月后配置、c.2個月后配置）通過流動相將儲備液稀釋為0.050、0.100、0.500、1.00、2.00、4.00mg/mL的系列IgY標準品并上樣，以IgY標準溶液的濃度為橫坐標，以其相應的峰面積為縱坐標，制作標準工作曲線，各標準溶液液相圖譜和標準曲線圖分別見圖16。本方法工作曲線為Y=1327.46845X+1.27635，R2=0.99999，線性范圍為：0.05mg/mL-4.00mg/mL。babafedcfedcgg圖SEQ圖\*ARABIC16標準曲線液相色譜譜圖(a:0.05mg/mL、b:0.10mg/mL、c:0.50mg/mL、d:1.00mg/mL、e:2.00mg/mL、f:4.00mg/mL、g:校準曲線）（5）方法的檢測限和定量限表720次平行測定禽蛋空白樣品的結(jié)果測定次數(shù)空白峰面積（mAU*s）峰面積標準偏差1108.218645.177862104.098593105.575594110.367555110.496136110.777467118.585718118.636709115.9460110112.9109611112.8962212112.8158313119.7538614119.8534515108.6677816108.3753217107.4024118106.9811319105.3924120104.26540本研究采用了兩種測定低限的實驗方法。其一，如表7所示，對IgY含量最低的鴨蛋進行20次平行測定，以此所得到禽蛋空白值峰值的標準偏差為5.17786，圖16中標準曲線的斜率為1327.46845。根據(jù)《GB/T27404-2008附錄F.4測定低限》的公式計算得到測定低限（檢出限）：，（CL-方法的測定低限、Sb-空白值標準偏差、b-方法校準曲線的斜率、V1-提取體積、V2-移取體積、V3-定容體積）計算得到的本方法的測定低限0.012mg/g。遠低于多批次實驗中，本底檢測值最低的鴨蛋（約1.00mg/g），故無法通過實際樣品加標回收實驗說明0.012mg/g可以為本方法的測定低限。其二，在本試驗條件下，將配置的0.05mg/mL的IgY標準溶液進行測定，如圖17所示，得到信噪比（S/N）=95.2，根據(jù)檢出限計算公式和樣品前處理的稀釋倍數(shù)，得出方法的檢測限為0.0157mg/g，定量限為0.0525mg/g，同樣遠低于禽蛋中本底檢測值最低的鴨蛋（約1.00mg/g）。故也沒辦法通過計算信噪比的方式來確定方法的檢測限和定量限。（計算公式如下：檢出限（MDL）（mg/g）=3C/（S/N）；定量限（MDL）（mg/g）=10C/（S/N）（C=加標濃度、S/N=信噪比））圖SEQ圖\*ARABIC17方法檢測限圖譜依據(jù)《GB/T27417-20175.4.1》—需要評估檢出限（LOD）和定量限（LOQ）的情況，通常情況下，只有當目標分析物的含量在接近于“零”的時候才需要確定方法的需要評估檢出限（LOD）或定量限（LOQ）。當分析物濃度遠大于LOQ時，沒有必要評估方法的LOD和LOQ。IgY是禽類通過免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生的抗體，蓄積于禽蛋蛋黃中，目前市面上所有的禽蛋均含有較高的IgY含量，沒有絕對空白樣品，故無需制定方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。綜上所述，本標準擬不評估方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。（6）實際樣品測定從山東省煙臺、湖北仙桃、江西贛州、廣東東莞、廣東清遠、廣東惠州等供深禽蛋產(chǎn)地采購各種類型的禽蛋（雞蛋、鵪鶉蛋、鴿子蛋、鴨蛋、鵝蛋）各20批次，禽蛋黃樣品按照IgY提取方式處理后得到粗提液，經(jīng)濾膜過濾后進樣液相檢測。檢測結(jié)果如表8所示。表8實際樣品中IgY含量測定結(jié)果禽蛋種類IgY含量（mg/g）雞蛋7.41~13.84鵪鶉蛋2.40~4.64鴿子蛋6.84~12.61鴨蛋1.00~1.71鵝蛋1.76~3.11由表中數(shù)據(jù)可以看出不同產(chǎn)地，根據(jù)其不同的養(yǎng)殖環(huán)境、飼養(yǎng)條件以及個體差異，IgY含量會產(chǎn)生較大的波動。為了解決這個問題，在本研究中，我們選擇了不同批次禽蛋樣品的中間值作為本底值，以進行加標實驗。這種方法可以更準確地進行定量分析，以消除不同產(chǎn)地之間的變異性。將雞蛋本底值確定為10mg/g、鵪鶉蛋本底值為3mg/g、鴿子蛋本底值為10mg/g、鴨蛋本底值為1.5mg/g、鵝蛋本底值為2.5mg/g。不同禽蛋基質(zhì)樣品圖譜見圖18。ababcdcdee圖SEQ圖\*ARABIC18不同禽蛋實際樣品液相色譜圖（a:雞蛋；b:鵪鶉蛋；c：鴿子蛋；d：鴨蛋；e:鵝蛋）（7）回收率及精密度準確稱取禽蛋蛋黃液2.00g（精確至0.01g）于25.0mL比色管中，蛋黃液中按0.5、1、2倍本底值的IgY標品添加量完成低、中、高三個的維度添加水平，加入純水稀釋并定容至25mL，振搖混勻后，用1.00mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.00±0.05。冰浴條件下超聲30min，0℃~4℃冷藏靜置12h，離心（0℃~4℃，6000r/min）20min，收集上清液，上清液中加入5.00mL正己烷，振搖混勻后，離心（0℃~4℃，6000r/min）20min，棄去上層正己烷，取1mL~2mL溶液過0.22μm濾膜，所得濾液供高效液相色譜檢測分析用，加標樣品圖譜見圖19。在相同測定條件下檢測各組樣品中IgY的含量，重復測定6次，測定結(jié)果見表9、表10，結(jié)果表明，IgY的加標回收率范圍為75.0%~105.3%，RSD為0.6%～5.4%，相對標準偏差小于10%。方法的準確度和精密度符合原食藥總局2017年第203號文附件《食品補充檢驗方法研制指南》的要求。表9不同禽蛋中IgY精密度檢測記錄表（n=6）樣品添加濃度mg/g測定值（mg/g）平均測定值（mg/g）SRSD％123456雞蛋54.2874.1654.2234.2734.1744.2014.2210.0511.2108.0308.0278.1387.6737.6647.7337.8780.2112.72015.88315.81715.63615.86116.03615.64615.8130.1521.0鵪鶉蛋1.51.5091.3461.4491.5111.5791.5051.4830.0795.432.7932.6562.9872.8652.7572.9792.8400.1304.665.1775.3335.3775.3875.3755.4315.3470.0891.7鴿子蛋54.3824.2934.2794.0224.0133.9824.1620.1754.3108.2178.0847.8947.9908.1828.0878.0760.1201.52016.00316.05816.04715.85515.86315.88615.9520.0940.6鴨蛋0.750.6960.7000.6990.6960.6880.6870.6940.0060.81.51.2371.2921.3341.3081.2591.2881.2860.0352.732.5582.4532.5152.6022.5602.5152.5340.0512.1鵝蛋1.251.1761.2121.1971.2121.2531.2331.2140.0272.32.51.9682.0052.0741.9812.0602.0202.0180.0422.153.8343.8603.7523.9053.8493.9033.8510.0561.5表10不同禽蛋中IgY加標量回收率記錄表（n=6）樣品添加濃度mg/g回收率（％）平均回收率％回收率范圍/％123456雞蛋585.783.384.585.583.584.084.483.3~85.71080.380.381.476.776.677.378.876.6~81.42079.479.178.279.380.278.279.178.2~80.2鵪鶉蛋1.5100.689.796.6100.7105.3100.398.989.7~105.3393.188.599.695.591.999.394.788.5~99.6686.388.989.689.889.690.589.186.3~90.5鴿子蛋587.685.985.680.480.379.683.279.6~87.61082.280.878.979.981.880.980.878.9~82.22080.080.380.279.379.379.479.879.3~80.3鴨蛋0.7592.893.393.292.891.791.692.691.6~93.31.582.586.188.987.283.985.985.882.5~88.9385.381.883.886.785.383.884.581.8~86.7鵝蛋1.2594.197.095.897.0100.298.697.194.1~100.22.578.780.283.079.282.480.880.778.7~83.0576.777.275.078.177.078.177.075.0~78.1aabcde圖19不同禽蛋實際樣品2倍本底值加標液相色譜圖（a:雞蛋；b:鵪鶉蛋；c：鴿子蛋；d：鴨蛋；e:鵝蛋）試驗驗證的分析、綜述報告，技術經(jīng)濟論證，預期的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益（一）試驗驗證的分析及綜述報告根據(jù)方法驗證要求，2023年組織3家有資質(zhì)的檢測單位農(nóng)業(yè)農(nóng)村部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心（揚州）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（廣州）、譜尼測試集團深圳有限公司，對《禽蛋中卵黃免疫球蛋白的測定高效液相色譜法》進行了方法學驗證，儀器參數(shù)條件、前處理方法和各項性能指標均能滿足標準方法要求。三家驗證單位選取雞蛋、鴿子蛋、鵪鶉蛋、鵝蛋、鴨蛋等5種基質(zhì)，覆蓋了市面上常見禽蛋基質(zhì)，對其進行添加回收實驗和精密度實驗。將驗證數(shù)據(jù)進行匯總，三家驗證報告表明，在線性范圍內(nèi)，實驗結(jié)果線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.990。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心(揚州)對鴿子蛋、鵪鶉蛋、鵝蛋樣品中IgY進行了加標檢測，其回收率范圍分別在84.7%~98.8%、72.2%~98.9%與79.5%~102.8%之間，變異系數(shù)在0.68%~2.83%、2.40%~5.28%、1.90%~2.94%之間。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（廣州）對雞蛋、鴨蛋樣品進行了IgY的加標檢測，回收率范圍分別在78.2%~96.0%與76.4%~93.5%之間，變異系數(shù)在0.65%~6.00%與1.80%~5.30%之間。譜尼測試集團深圳有限公司對鴨蛋、鵝蛋樣品中IgY的加標檢測，回收率范圍分別在80.2%~100.1%與73.0%~101.8%之間，變異系數(shù)在1.19%~2.60%與3.96%~6.93%之間。三家驗證機構變異系數(shù)范圍均小于10%。驗證實驗表明本標準方法符合相關要求，實驗數(shù)據(jù)見驗證報告。（二）技術經(jīng)濟論證采用高效液相色譜法（HPLC）進行禽蛋卵黃中免疫球蛋白IgY的測定具有顯著的技術優(yōu)勢、經(jīng)濟效益和社會影響。技術優(yōu)勢：HPLC技術在禽蛋卵黃中免疫球蛋白IgY的測定方面具有高選擇性、高靈敏度和高分辨率，能夠準確識別和分離目標成分，最大程度地消除干擾物質(zhì)，可精確測量較低濃度的目標物質(zhì)，實現(xiàn)對免疫球蛋白IgY的高靈敏度檢測，同時通過調(diào)整分析條件和選擇適當?shù)闹暮土鲃酉?，能夠?qū)崿F(xiàn)對復雜基質(zhì)樣品的高分辨率分析，準確識別和定量各組分。經(jīng)濟效益：HPLC技術能夠快速、準確地測定禽蛋卵黃中免疫球蛋白IgY的含量，為生產(chǎn)企業(yè)提供一個高效的質(zhì)量控制工具。能有效監(jiān)測禽類養(yǎng)殖時IgY含量，識別和控制生產(chǎn)中的問題，提高生產(chǎn)效率。采用HPLC技術，提供了高通量和自動化分析的可能性，減少了人力和時間成本。最后HPLC技術方法的準確測定，能夠確保禽蛋產(chǎn)品中免疫球蛋白IgY的質(zhì)量符合標準，提升產(chǎn)品的附加值，增強市場競爭力。社會影響：HPLC技術確保禽蛋卵黃中免疫球蛋白IgY的含量符合食品安全標準，保障消費者的健康權益。同時促進了分析方法的創(chuàng)新和發(fā)展，推動科學研究的進展，提高行業(yè)的技術水平和競爭力。使用高效液相色譜對禽蛋卵黃中免疫球蛋白IgY進行測定具有廣闊的應用前景和潛力。（三）預期的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益；經(jīng)濟效益：a.提質(zhì)提效：本標準的制定填補了目前市場上缺乏相關行業(yè)標準的空白，通過水相稀釋法和尺寸排阻色譜柱進行液相檢測，加快了分析速度，適用于批量檢測，有助于降低勞動成本、提高樣品處理能力和檢測效率。b.降低成本：統(tǒng)一的檢測標準最大化資源分配，減少試劑浪費，充分利用設備，降低物料和運營成本，實現(xiàn)成本節(jié)約。c.提升市場競爭力：本標準的制定為企業(yè)提供了公平競爭的基礎，促進市場競爭力的提升，推動技術和方法的創(chuàng)新，促進行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。社會效益：a.保護消費者權益：行業(yè)標準的實施確保向消費者提供安全可靠的禽蛋產(chǎn)品，通過準確的卵黃免疫球蛋白IgY定量檢測，減少受污染或質(zhì)量不合格產(chǎn)品帶來的風險，保護消費者健康，增強對行業(yè)的信任。b.產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定：本標準的制定建立了卵黃免疫球蛋白IgY檢測標準，確保不同產(chǎn)地禽蛋生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，提升消費者信心，促進客戶忠誠度和滿意度，樹立良好的行業(yè)形象。c.促進貿(mào)易發(fā)展：統(tǒng)一的檢測標準促進禽蛋IgY制品的跨境貿(mào)易，降低貿(mào)易壁壘，擴大市場準入，促進國際合作。生態(tài)效益：本標準采用的水相稀釋法和尺寸排阻色譜柱優(yōu)化了資源利用，減少了試劑和溶劑的使用量，節(jié)約水資源，減少化學廢物產(chǎn)生，降低環(huán)境污染風險，促進綠色和可持續(xù)發(fā)展，維護生態(tài)系統(tǒng)的健康與生物多樣性?？偟膩碚f，制定禽蛋內(nèi)卵