分子細胞生物學實驗技術(shù)

實驗一細胞傳代一、實驗目的學習細胞傳代辦法，擴增細胞，建立細胞系。二、實驗原理培養(yǎng)細胞傳代根據(jù)不同細胞采用不同的辦法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打可傳代；懸浮生長的細胞能夠采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。三、實驗材料（一）儀器：凈化工作臺、離心機、冰箱（4℃、-20℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱（二）玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、玻璃瓶（250ml、100ml）、培養(yǎng)瓶、試管（三）塑料器皿：槍頭（10ul、100ul、1ml）、膠塞、15ml離心管、EP管（四）其它物品：微量加樣槍、廢液缸（五）試劑：PBS緩沖液、小牛血清、DMEM、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.25%+EDTA）四、實驗環(huán)節(jié)洗手進入超凈工作室，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，密度。點燃超凈臺內(nèi)酒精燈，打開所需試劑瓶，準備試管、吸管備用。打開培養(yǎng)瓶，吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。PBS緩沖液洗2次。向瓶內(nèi)加入消化液10滴，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍全部細胞表面，室溫進行消化5分鐘。5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大，部分細胞開始脫落，立刻加入2mL培養(yǎng)基終止消化。用吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，重復吹打瓶壁細胞，使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm/min，離心10min。棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基2mL，重懸細胞。計數(shù)，按1：2的比例分裝到兩個培養(yǎng)瓶中。24小時后，觀察細胞狀態(tài)。（如圖）24小時后，觀察細胞狀態(tài)。（如圖）細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部，長條形、帶觸角，貼壁生長。細胞大量增值，已出現(xiàn)漂浮的死細胞。上圖為A549傳代后細胞×100六、討論1.傳代前，用適量培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)，按照適宜的比例分裝細胞，避免細胞數(shù)量過多，而出現(xiàn)上圖中24小時后即出現(xiàn)密度克制，并有死細胞。2．離心轉(zhuǎn)速要適宜，轉(zhuǎn)速過低，不能有效分離細胞，離心速度過大，時間過長，會擠壓細胞造成損傷甚至死亡。實驗二細胞凍存和復蘇一、實驗目的學習細胞凍存和復蘇的辦法，掌握長久保存體外培養(yǎng)細胞的技術(shù)。二、實驗原理細胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的多個生物特性都將逐步發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不停有新的變化。因此及時進行細胞凍存。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中能夠保存一年之久；細胞儲存在液氮中，溫度達-196細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣能夠最大程度的保存細胞活力?，F(xiàn)在細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的辦法，這樣能夠確保細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。三、實驗材料（一）儀器：凈化工作臺、離心機、冰箱（4℃、-20℃、-70℃（二）玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、玻璃瓶（250ml、100ml）、培養(yǎng)瓶、試管（三）塑料器皿：槍頭（10ul、100ul、1ml）、膠塞、15ml離心管、EP管（四）其它物品：微量加樣槍、廢液缸（五）試劑：PBS緩沖液、小牛血清、DMEM、雙抗、胰蛋白酶（0.25%+EDTA）、DMSO四、實驗環(huán)節(jié)（一）細胞凍存洗手進入超凈工作室，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，密度。點燃超凈臺內(nèi)酒精燈，打開所需試劑瓶，準備試管、吸管備用。打開培養(yǎng)瓶，吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。PBS液洗2次。向瓶內(nèi)加入消化液10滴，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍全部細胞表面，室溫進行消化5分鐘。5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大，部分細胞開始脫落，立刻終止消化。用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，重復吹打瓶壁細胞，使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm/min，離心10分鐘。棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基2mL，重懸細胞。計數(shù)，按1：2的比例，1mL分裝到培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)；另1ml分裝入已加入100ulDMSO的凍存管中。在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；凍存：4℃30min,-20℃30min,-70℃30min,移入液氮容器內(nèi)。（二）細胞復蘇從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃從37℃離心，1000rpm，10min；棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。五、實驗成果細胞復蘇24小時后，觀察細胞狀態(tài)（如圖）：部分A549細胞貼壁生長細胞復蘇24小時后，觀察細胞狀態(tài)（如圖）：部分A549細胞貼壁生長，長條形，帶觸角。但是細胞數(shù)量少，培養(yǎng)基液面漂浮大量死細胞。上圖為細胞復蘇24h后狀態(tài)×100六、討論由實驗一可見，本實驗選用的凍存細胞出現(xiàn)密度克制，狀態(tài)不及對數(shù)生長久的細胞，凍存過程中操作不純熟，因此復蘇后死細胞諸多。凍存前，未進行細胞計數(shù)，凍存的細胞數(shù)量未達成107,凍存后活細胞數(shù)量很低。增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都能夠用于凍存，但最佳為對數(shù)生長久細胞。根據(jù)不同的細胞，適量調(diào)節(jié)DMSO的濃度。如果胰酶中有EDTA，每次傳代是要離心棄除，否則在細胞體內(nèi)蓄積會產(chǎn)生毒性。這樣的凍存細胞復蘇后死亡率也很高。實驗三細胞生長曲線、四唑鹽實驗（MTT）比色實驗一、實驗目的學習四唑鹽比色實驗，檢測細胞存活和生長狀況。二、實驗原理四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，簡稱MTT。活細胞的線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功效。二甲基亞砜能溶解細胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波優(yōu)點測定其光吸取值，可間接反映細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范疇內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細胞數(shù)成正比。三、實驗材料（一）儀器：凈化工作臺、離心機、冰箱（4℃）、倒置相差顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、細胞計數(shù)儀、恒溫水浴箱、酶聯(lián)免疫檢測儀、移液槍、電磁力攪拌機、微孔濾器（二）玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、玻璃瓶（250ml、100ml）、培養(yǎng)瓶、試管（三）塑料器皿：吸頭、槍頭（10ul、100ul、1ml）、膠塞、15ml離心管、EP管（四）其它物品：微量加樣槍、廢液缸（五）試劑：PBS緩沖液、小牛血清、DMEM、雙抗、胰蛋白酶（0.25%+EDTA）、DMSO、MTT溶液（稱取250mgMTT，放入小燒杯中，加50ml培養(yǎng)液或平衡鹽溶液在電磁力攪拌機上攪拌30min，用0.22um的微孔濾器除菌，分裝，4℃保存?zhèn)溆?，兩周?nèi)有效。四、實驗環(huán)節(jié)洗手進入超凈工作室，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，密度。點燃超凈臺內(nèi)酒精燈，打開所需試劑瓶，準備試管、吸管備用。打開培養(yǎng)瓶，吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。PBS液洗2次。向瓶內(nèi)加入消化液10滴，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍全部細胞表面，室溫進行消化5分鐘。5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大，部分細胞開始脫落，立刻終止消化。用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，重復吹打瓶壁細胞，使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm/min，離心10min。棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基2mL，重懸細胞，計數(shù)為1×106。96孔板中接種細胞：每孔接種細胞的數(shù)量分別為2×105、1.5×105、1×105，0.5×105、0.25×105，每孔補充培養(yǎng)基至200ul。培養(yǎng)細胞：將96孔板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37℃孵箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸取值，統(tǒng)計成果。以細胞數(shù)量為橫軸，光吸取值為縱軸繪制細胞生長曲線。五、實驗成果實驗組細胞數(shù)量（個）001500001000005000025000吸光度1.9921.731.3820.8790.569老師對照組細胞數(shù)量（個）00100000500002500012500吸光度11.2380.8780.5660.3360.246吸光度21.1620.6750.4690.3260.218均值1.20.77650.51750.3310.232由上圖細胞生長曲線可見，隨著細胞密度增加，吸光度增加，細胞處在生長久。但是吸光度值沒有隨著細胞數(shù)量的倍數(shù)增加而倍增，推測細胞可能不是處在對數(shù)生長久。由原始數(shù)據(jù)分析可能是進入對數(shù)生長后期，靠近停滯期。實驗組的斜率略高于老師對照組，闡明實驗組的細胞活力略高于老師對照組。六、討論1.繪制細胞生長曲線，每孔接種同樣濃度的細胞，不同天數(shù)進行觀察。應為吸光度、時間的S型曲線。選用對數(shù)生長久細胞，作為實驗對象。本實驗細胞活力有所下降的因素分析：細胞活力本身就有所下降，有實驗一推理得出；接種的細胞密度過大，出現(xiàn)密度克制。調(diào)節(jié)最適的細胞密度培養(yǎng)檢測2.選擇適宜的細胞接種濃度。在進行MTT實驗前，對每一種細胞都應測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，然后擬定實驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間。3.避免血清干擾，普通選不大于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行實驗。4.設空白對照，與實驗平行設不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。最后比色時，以空白孔調(diào)零。每個檢測值設復孔最少2個，計算平均值，減少實驗誤差。實驗四 核蛋白的免疫熒光定位一、實驗目的學習間接法免疫熒光定位技術(shù)，定位細胞核PCNA蛋白。二、實驗原理使用第一抗體作用于細胞的特定抗原，用PBS洗去未與抗原結(jié)合的第一抗體，再用熒光素標記的第二抗體作用于與抗原結(jié)合的第一抗體，形成抗原-第一抗體-第二抗體復合物，熒光部位即為抗原部位。三、實驗材料熒光顯微鏡100%甲醇、24孔板、1%normalgoatserum(NGS)、一抗：鼠抗人增殖細胞核抗原抗體（Proliferativecellnuclearantigenantibody,PCNA）、二抗：FITC標記的羊抗鼠IgG。四、實驗環(huán)節(jié)24孔板培養(yǎng)A549細胞。細胞應長到50%-70%匯合。棄除每孔培養(yǎng)基，用冰凍100%甲醇固定細胞3分鐘。棄除甲醇，用PBS緩沖液洗三次，每次5分鐘。用NGS約500ul室溫孵育10分鐘。加300u抗體工作液于待測孔和陽性對照孔，室溫孵育30min。用PBS緩沖液洗三次，每次5分鐘。加入稀釋好的熒光標記二抗室溫孵育30min。用PBS洗5次，每次5分鐘。熒光顯微鏡下觀察成果。五、實驗成果1．待測樣品孔：可見不同亮度（++，+）的綠色熒光，但是標有熒光的細胞數(shù)量不多。背景高2．熒光抗體對照：細胞內(nèi)未見明顯的綠色熒光，但是背景高。3.自發(fā)熒光對照：未見綠色熒光，無背景。4．陽性對照：未做。由于本實驗的檢測蛋白即為其它實驗的陽性對照。由此能夠得出結(jié)論，待測樣品細胞核中存在PCNA蛋白。六、討論1.背景高的因素：封閉也為正常的山羊血清，第二抗體為FITC標記的羊抗鼠IgG，與封閉液含有同源性，因此背景高。孵育第二抗體后，沖洗不干凈，也會造成背景高。2.待定性的核蛋白陽性率低的因素：背景高，直接造成諸多信號不能確認與否為陽性；第一抗體的濃度低，與檢測抗原的結(jié)合不夠；第一抗體的孵育時間過短，4℃實驗五脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗一、實驗目的掌握將質(zhì)粒等外源DNA導入真核細胞的辦法二、實驗原理外源核酸導入細胞的辦法有病毒顆粒轉(zhuǎn)導法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、DMSO（二甲基亞砜）轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導法、顯微注射（基因槍）、電穿孔等多個辦法。其中最慣用到的就是脂質(zhì)體介導法。脂質(zhì)體運用與細胞的脂質(zhì)雙層膜的構(gòu)造類似，將夾帶的外源DNA以胞吞的方式進入細胞質(zhì)，甚至細胞核中。三、實驗材料試劑：PBS緩沖液、DMEM、胰蛋白酶（0.25%+EDTA）、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、脂質(zhì)體耗材：24孔細胞培養(yǎng)板、槍頭（10ul、100ul、1000ul）、吸管四、實驗環(huán)節(jié)1.培養(yǎng)好的細胞接種細胞孔板，37℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞密度為80%～2.待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合物制備：A液：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒0.8ug稀釋至無血清DMEM培養(yǎng)基中50ul，混勻，室溫放置5min；B液：脂質(zhì)體2ul稀釋至50ul無血清DMEM培養(yǎng)基中，混勻，室溫放置5min；A、B液混勻，室溫放置30min。3.取出細胞孔板，棄培養(yǎng)液，用PBS液洗滌2次，待用。4.屆時間后，將混合物導入細胞中，加入1.5ml無血清DMEM培養(yǎng)基，37℃5.24小時后熒光顯微鏡觀察熒光狀況。6.拍照統(tǒng)計適宜的細胞熒光成果。五、實驗成果轉(zhuǎn)染peGFP24小時后，觀察成果（如圖）：大部分A549細胞內(nèi)體現(xiàn)了GFP轉(zhuǎn)染peGFP24小時后，觀察成果（如圖）：大部分A549細胞內(nèi)體現(xiàn)了GFP綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染效率約達成60%。但是細胞狀態(tài)不好，貼壁不牢。尚有少量陽性細胞胞質(zhì)回縮，可能死亡。上圖為A549細胞轉(zhuǎn)染進GFP×200六、討論轉(zhuǎn)染后細胞狀態(tài)差，少量死亡的因素：選用的待轉(zhuǎn)染細胞，不是處在對數(shù)生長久，生長狀況不佳。脂質(zhì)體的濃度過高，脂質(zhì)體本身含有毒性，轉(zhuǎn)進入細胞內(nèi)的量多，產(chǎn)生了細胞毒性。接種的細胞過密，轉(zhuǎn)染后，細胞出現(xiàn)了密度移植，因此會有死細胞出現(xiàn)。影響轉(zhuǎn)染效率的因素：脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒的作用時間不夠，普通來說不少于30分鐘。包裹了質(zhì)粒的脂質(zhì)體在30min～6h，都是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，在此時間內(nèi)，轉(zhuǎn)染時間越長，效率越高。6h后換有血清的培養(yǎng)基，減少脂質(zhì)體的毒性作用，轉(zhuǎn)染后的細胞狀態(tài)更加好，陽性率會提高。實驗六PI染色法測細胞周期一、實驗目的學習通過核酸染料-PI（碘化丙錠）標記細胞DNA，由流式細胞儀采集后進行細胞周期分析的辦法。二、實驗原理正常人靜止體細胞有46條染色體，相稱于7.10-12pgDNA/細胞核，我們稱之為二倍體細胞，而正常增殖細胞則存在不同的DNA含量。在細胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各個時期，DNA含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化：在G1期，細胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體；進入S期后，DNA開始合成，這時細胞核內(nèi)DNA的含量介于G1和G2期之間；當DNA復制結(jié)束成為4倍體時，細胞進入G2期，G2期細胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進入M期，因此，單純從DNA含量無法分辨G2期和M期；一旦有絲分裂發(fā)生，細胞分裂成兩個子細胞，這兩個子細胞或者進入下一種細胞周期，或者進入靜止期(G0期)，而G0期從DNA含量上同樣無法與G1期分辨。因此，整個復制周期能夠描述為G0/G1，S，G2/M期。通過核酸染料標記DNA，并由流式細胞儀進行分析，能夠得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1，S及G2/M的百分含量，理解細胞的增殖能力；結(jié)合DNA指數(shù)分析，還可進行凋亡、異倍體等檢測。三、實驗材料試劑：PBS（PH為7.2-7.4）、80%乙醇、PI染液（含PI、TritonX-100等）。耗材：吸頭（10ul、100ul、1ml）、與吸頭配套的加樣槍、流式試管等儀器設備：流式細胞儀（488nm激發(fā)）四、實驗環(huán)節(jié)開培養(yǎng)瓶，吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。PBS緩沖液洗2次。向瓶內(nèi)加入