單克隆抗體的制備及應(yīng)用

單克隆抗體的制備及應(yīng)用單克隆抗體是由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對(duì)復(fù)合抗原分子上某一單個(gè)抗原決定簇。單克隆抗體技術(shù)(monoclonalantibodytechnique)：一種免疫學(xué)技術(shù)，將產(chǎn)生抗體的單個(gè)B淋巴細(xì)胞同骨髓腫瘤細(xì)胞雜交，獲得既能產(chǎn)生抗體，又能無(wú)限增殖的雜種細(xì)胞，并以此生產(chǎn)抗體。是僅由一種類型的細(xì)胞制造出來(lái)的抗體，對(duì)應(yīng)于多克隆抗體、多株抗體——由多種類型的細(xì)胞制造出來(lái)的一種抗體。1單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性：1.1單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：(1)雜交瘤可以在體外“永久”地存活并傳代，只要不發(fā)生細(xì)胞株的基因突變，就可以不斷地生產(chǎn)高特異性、高均一性的抗體。(2)可以用相對(duì)不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。(3)由于可能得到“無(wú)限量”的均一性抗體，所以適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于單克隆抗體的高特異性和單一生物學(xué)功能，可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療。總體來(lái)說(shuō)，即：高特異性、高純度、重復(fù)性好、敏感性強(qiáng)、成本低和可大量生產(chǎn)等。1.2單克隆抗體的局限性：(1)單克隆抗體固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍。由于單克隆抗體不能進(jìn)行沉淀和凝集反應(yīng)，所以很多檢測(cè)方法不能用單克隆抗體完成。(2)單克隆抗體的反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體。(3)制備技術(shù)復(fù)雜，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)工，所以單克隆抗體的價(jià)格也較高。2單克隆抗體的制備：?jiǎn)慰寺】贵w的制備原理：應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來(lái)源于單個(gè)融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。單克隆抗體的制備過(guò)程：抗原準(zhǔn)備、動(dòng)物的選擇與免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測(cè)、雜交瘤的克隆化、雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇、單克隆抗體的純化等步驟。2.1抗原準(zhǔn)備抗原，是指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)。抗原的基本特性有兩種，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是抗原性。很多物質(zhì)都可以成為抗原，抗原的具體分類可以參見(jiàn)抗原，在進(jìn)行單克隆抗體制備過(guò)程中，很多物質(zhì)都可以成為抗原，在常規(guī)的科研實(shí)驗(yàn)中，科研者經(jīng)常選用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug重組蛋白、偶聯(lián)多肽、偶聯(lián)小分子等作為抗原產(chǎn)生特異性的單克隆抗體。2.2動(dòng)物的選擇與免疫2.2.1動(dòng)物的選擇純BALB/c小鼠，較溫順，離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活目開(kāi)展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALA/c小鼠。2.2.2免疫方案選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩月左右根據(jù)確立免疫方案開(kāi)始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml，0.2ml/點(diǎn)），3周后第二次免疫，劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過(guò)0.5ml），3周后第三次免疫，劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測(cè)其效價(jià)），2～3周加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射)，3天后取脾融合。（2）顆?？乖庖咝詮?qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時(shí)要求抗原量為1～2×107個(gè)細(xì)胞。初次免疫1×107/0.5mlip，2～3周后，第二次免疫1×107/0.5mlip，3周后加強(qiáng)免疫（融合前三天）1×107/0.5mlip或iv，取脾融合。2.3細(xì)胞融合2.3.1細(xì)胞融合前準(zhǔn)備（1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生量McAb。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細(xì)胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過(guò)106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)生長(zhǎng)的中期時(shí)，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細(xì)胞在傳代過(guò)程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥(niǎo)嘌呤進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對(duì)HAT呈均一的敏感性。（2）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長(zhǎng)繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104或105細(xì)胞/孔。2.3.2細(xì)胞融合的步驟①將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無(wú)血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm，8min；棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。②90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。37℃水浴作用90s。所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來(lái)確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。2.8.5McAb親合力的鑒定用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。2.9單克隆抗體制備的影響因素：污染。2、PEG有毒性，可能作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，牛血清質(zhì)量差，骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體，HAT有問(wèn)題，融合后雜交瘤細(xì)胞不生長(zhǎng)。3免疫原抗原性弱，免疫效果不好，融合后有細(xì)胞生長(zhǎng)，但無(wú)抗體產(chǎn)生（可能是HAT中的A失效，或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞），原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮裕赡苁侵гw污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)），使雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體。4小牛血清質(zhì)量問(wèn)題，雜交瘤細(xì)胞活性狀態(tài)，細(xì)胞有支原體污染，使雜交瘤細(xì)胞難以克隆化等。3單克隆抗體的應(yīng)用：1．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑目前，應(yīng)用單克隆抗體制作的商品化試劑盒廣泛應(yīng)用于：①病原微生物抗原、抗體的檢測(cè)；②腫瘤抗原的檢測(cè)；③免疫細(xì)胞及其亞群的的檢測(cè)；④激素測(cè)定；⑤細(xì)胞因子的測(cè)定。單克隆抗體對(duì)抗原的識(shí)別，與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因使用的單克隆抗體不同，識(shí)別抗原的位點(diǎn)不同，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有一定差異。因此，標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題還需要進(jìn)一步研究。2．蛋白質(zhì)的提純單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個(gè)惰性的固相基質(zhì)上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時(shí)，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，欲分離的抗原與