還原糖含量測定方法的比較

還原糖含量測定方法的比較

3、5-二硝酸（dns）的比色法是測定還原糖的常用方法。該方法具有簡便、快速、靈敏度高等特點(diǎn);同時(shí),通過該方法測定還原力,還可以用于判斷普魯蘭酶(pullulanase)等脫支酶對淀粉的脫支效果。但在采用該方法進(jìn)行測定時(shí),不同文獻(xiàn)介紹的測定條件有較大差異,從而影響了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。本實(shí)驗(yàn)對DNS比色法測定條件進(jìn)行探討,指出影響分析測定的關(guān)鍵因素,使測定結(jié)果更具準(zhǔn)確性和可比性,以利于實(shí)際采用該方法進(jìn)行相關(guān)分析測定時(shí)參考應(yīng)用。1材料和方法1.1杰能科公司的紡粘設(shè)備玉米淀粉黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司。普魯蘭酶(酶活1000ASPu/g)美國杰能科公司;3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、丙三醇、苯酚、亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、醋酸鈉、冰乙酸,以上藥品為分析純。1.2-型熱電鼓風(fēng)箱SP-721E型可見分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司;Acculab精密電子天平;702-型電熱鼓風(fēng)箱大連干燥箱廠;DZF-6050型真空干燥箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;THZ-82A水浴恒溫振蕩器江蘇榮華儀器制造有限公司;80-2離心機(jī)上海浦東物理光學(xué)儀器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司。1.3方法1.3.1丙三醇溶液配制試劑1:稱取3.25g3,5-二硝基水楊酸溶于少量水中,移入500ml容量瓶,加2mol/L氫氧化鈉溶液162.5ml,再加入22.5g丙三醇,搖勻,定容至500ml,儲(chǔ)存于棕色瓶放置在冰箱中待用。試劑2:稱取2.5g3,5-二硝基水楊酸溶于少量水中,加入0.5g苯酚,再溶解0.075g亞硫酸鈉、2.5g氫氧化鈉和50g酒石酸鉀鈉,移入500ml容量瓶,搖勻,定容至500ml,儲(chǔ)存于棕色瓶放置在冰箱中待用。1.3.2糖液的制備稱取大于1g的葡萄糖置于熱風(fēng)干燥箱98℃干燥至恒重,準(zhǔn)確稱取1.000g葡萄糖,用蒸餾水溶解并定容至1000ml。分別按表1進(jìn)行配置操作,充分混勻后于沸水浴中加熱煮沸5min。流水沖冷卻后再分別向各試管中加入蒸餾水4ml,混勻。以管1為空白對照,540nm波長下測各管的吸光度。繪制吸光度-葡萄糖濃度曲線。1.3.3乙酸鈉緩沖溶液的制備A液:0.2mol/L乙酸溶液;B液:0.2mol/L乙酸鈉溶液。按比例配制不同pH(4.0~5.0)緩沖液。1.3.4ds試劑加熱取0.5ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液及0.5ml蒸餾水分別置于10ml試管中,再各加1.5mlDNS試劑,沸水浴加熱5min,流水冷卻,蒸餾水定容。將葡萄糖顯色液-水(空白)、DNS試劑-水(空白)、葡萄糖顯色液-DNS試劑(空白)分別在波長400~600nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。1.3.5ds試劑添加在準(zhǔn)確加入0.5ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的系列10ml試管中,分別加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml的DNS試劑,沸水浴加熱5min,流水冷卻、定容。以相同條件下不加葡萄糖標(biāo)液作空白溶液,波長540nm下測定不同時(shí)間的吸光度。1.3.6ns試劑制備取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5ml及蒸餾水1ml于系列10ml試管中,分別加入DNS試劑,置沸水浴中加熱、反應(yīng)1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30min取出,流水冷卻,定容。以相同條件下不加葡萄糖標(biāo)液作空白溶液,在波長540nm下測不同加熱時(shí)間時(shí)溶液的吸光度。1.3.7ds試劑制備取10支管分別加入0.5ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和1.5mlDNS試劑,混勻并作空白,沸水浴加熱5min,流水冷卻、定容。以相同條件下不加葡萄糖標(biāo)液作空白溶液,波長540nm下測定吸光度。2結(jié)果與分析2.1最大吸收波長的確定DNS法即3,5-二硝基水楊酸比色法的測定原理是3,5-二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物——3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi),還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比。文獻(xiàn)中關(guān)于DNS法的測定波長有540、520、490nm等各不相同,為了進(jìn)一步確定DNS法在測定還原力過程中的最佳波長,考慮相關(guān)因素進(jìn)行波譜掃描,結(jié)果如圖1、2所示。在實(shí)驗(yàn)過程中,顯色之前空白和待測液中DNS試劑的添加量是相同的,但顯色期間由于部分DNS試劑與待測液中還原糖相結(jié)合,從而造成測定吸光度時(shí),空白中DNS試劑含量大于待測液中DNS試劑含量。從圖1可知,最大吸收峰處的波長為500nm。一般情況下,選取最大吸收峰處的波長進(jìn)行測定可以提高靈敏度,但由圖1可知,在此波長下DNS試劑也具有一定的吸光度(DNS試劑-水曲線)。再者,實(shí)驗(yàn)過程中,顯色之前空白和待測液中DNS試劑的添加量是相同的,但顯色期間由于部分DNS試劑與待測液中還原糖相結(jié)合,從而造成測定吸光度時(shí),空白中DNS試劑含量大于待測液中DNS試劑含量。故500nm下,DNS試劑對測定結(jié)果干擾嚴(yán)重。結(jié)合葡萄糖顯色液-水曲線可以看出,這種影響在λ<540nm的情況下一直很顯著。故本實(shí)驗(yàn)DNS試劑1最終確定的測定波長選為540nm,而不是500nm(最大吸收波長)。同理,由圖2可知,DNS試劑2最終確定的測定波長為550nm,而不是500nm(最大吸收波長)。2.2吸光度隨時(shí)間的變化由圖3可知,隨著沸水浴加熱時(shí)間的延長,吸光度變大,但兩種試劑均在5min之后吸光度基本不變,說明顯色反應(yīng)基本完成,吸光度較穩(wěn)定。故DNS試劑水浴加熱時(shí)間在5min即可。2.3試劑用量的影響由圖4、5可知,試劑用量和放置時(shí)間與吸光度值的關(guān)系,當(dāng)DNS試劑用量小于1.5ml時(shí),溶液吸光度隨DNS試劑用量的增加而增大,試劑用量在1.5~2ml時(shí),放置20min后吸光度值較穩(wěn)定。試劑一的用量為2~3ml時(shí)吸光度值波動(dòng)性較大。在實(shí)際測定中,兩種試劑的加入量可采用1.5ml。2.4精密度實(shí)驗(yàn)由表4和表5可知,在本實(shí)驗(yàn)條件下DNS試劑1的精密度優(yōu)于DNS試劑2。2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線兩種試劑的葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明,葡萄糖濃度在測定范圍內(nèi)顯色靈敏、穩(wěn)定且成良好線性。3最大吸收力量在堿性溶液中3,5-二硝基水楊酸被還原糖還原生成的氨基化