細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)1細(xì)胞膜的通透性【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私夥肿恿?、脂溶性大小、電解質(zhì)和非電解質(zhì)溶液對(duì)細(xì)胞膜透性的影響。【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞膜在不斷變化的環(huán)境中，必須保持自身的穩(wěn)恒狀態(tài)，才能生存。細(xì)胞膜允許一些物質(zhì)通透，又能降低甚至阻擋另一些物質(zhì)的通透，所以細(xì)胞膜具有選擇通透性。水分子可以自由通過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞處于低滲液環(huán)境時(shí)，水分子大量滲到細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞膨脹，進(jìn)而破裂，血紅蛋白釋放到介質(zhì)中，由不透明的紅細(xì)胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液，這就是溶血現(xiàn)象。溶血現(xiàn)象可作為測(cè)量物質(zhì)進(jìn)入紅血細(xì)胞速度的一種指標(biāo)。紅細(xì)胞置于乙二醇、丙三醇（甘油）、葡萄糖等摩爾濃度的高滲液中，乙二醇等分子進(jìn)入紅血細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的滲透性活性分子的濃度大為增加，繼而導(dǎo)致水的攝入，使細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜破裂，發(fā)生溶血。溶血現(xiàn)象發(fā)生的快慢與進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)的分子量大小有關(guān)。分子量大的進(jìn)入細(xì)胞慢，發(fā)生溶血所需時(shí)間也長。非極性化合物易溶于脂溶劑，但在水中溶解度甚小。碳鏈越長，脂溶性越大。一種化合物在脂溶劑中的溶解度與其在水中溶解度之比，叫分配系數(shù)。各種非電解質(zhì)溶液，只要單位面積中所含的分子數(shù)相同，就具有相同的滲透壓。電解質(zhì)溶液，如氯化鈉與葡萄糖分子數(shù)相等時(shí)，氯化鈉產(chǎn)生的滲透壓要大的多。具有相同滲透壓的某非電解溶液與某電解質(zhì)溶液濃度之比，叫等滲系數(shù)。用ⅰ來表示。ⅰ=葡萄糖的等滲摩爾濃度/氯化鈉的等滲摩爾濃度發(fā)生溶血者為低滲液，所以把發(fā)生溶血的前一管溶液的濃度近似視為紅細(xì)胞等滲?！緦?shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑】（一）儀器、用具小燒杯、試管、試管架、刻度吸管、注射器、秒表（二）材料含適量肝素的兔血或雞血（三）試劑1M乙二醇水溶液、1M丙三醇水溶液、1M葡萄糖水溶液、3M甲醇、3M乙醇、3M丙醇、M/8、M/9、M/10、M/12、M/14葡萄糖溶液、M/12、M/13、M/14、M/16、M/18氯化鈉溶液【方法與步驟】（一）分子量大小對(duì)膜通透性的影響1．在編號(hào)的三支試管中，分別用吸管吸入2ml1M乙二醇，1M丙三醇，1M葡萄糖高滲液。2．先后分別用注射器滴加兩滴血液，用手指按住管口，倒置一次。3．觀察溶血時(shí)間，最長延至10min。4．將實(shí)驗(yàn)結(jié)果列入如下所示的表格中。溶液分子量溶血時(shí)間1M乙二醇621M丙三醇921M葡萄糖180（二）脂溶性大小對(duì)細(xì)胞膜透性的影響1．編號(hào)的三支試管分別加入2ml3M的甲醇、乙醇、丙醇溶液。2．分別先后加入兩滴血液，按住管口倒置一次。3．觀察溶血時(shí)間。4．將實(shí)驗(yàn)結(jié)果記入如下所示的表格中。溶液分子量分配系數(shù)溶血時(shí)間3M甲醇32.040.00973M乙醇46.070.03573M丙醇58.00.156（三）電解質(zhì)和非電解質(zhì)溶液對(duì)細(xì)胞膜透性的影響1．將試管編號(hào)，注明溶質(zhì)名稱及摩爾濃度。2．按編號(hào)分別加入不同濃度的葡萄糖及氯化鈉溶液2ml。3．每管各加入兩滴血液，按住管口，倒置一次。4．室溫放置15min，觀察發(fā)生溶血的濃度，確定等滲濃度。5．按下表記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。溶液摩爾濃度M/8M/9M/10M/12M/13M/14M/16M/18葡萄糖氯化鈉6．計(jì)算等滲摩爾系數(shù)實(shí)驗(yàn)2雞紅細(xì)胞的體外融合【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．了解聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)體外細(xì)胞融合的基本原理。2．通過PEG誘導(dǎo)雞紅細(xì)胞之間的融合實(shí)驗(yàn)，初步掌握細(xì)胞融合的基本方法。【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞融合（cellfusion）又稱體細(xì)胞雜交，是指用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的體細(xì)胞融合成異核體細(xì)胞，隨后，異核體同步進(jìn)入有絲分裂，核膜崩潰，來自兩個(gè)親本細(xì)胞的基因組合在一起形成只含有一個(gè)細(xì)胞核的雜種細(xì)胞（hybridcell）。細(xì)胞融合技術(shù)是研究細(xì)胞遺傳、基因定位、細(xì)胞免疫、病毒和腫瘤的重要手段。依據(jù)融合過程采用的助融劑的不同，細(xì)胞融合可分為：（1）病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，如：仙臺(tái)病毒（hemagglutinatingvirusofJapan，HVJ）；（2）化學(xué)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，如：聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）；（3）電場(chǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞融合；（4）激光誘導(dǎo)的細(xì)胞融合。PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子質(zhì)量的多聚體。PEG可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處脂類分子發(fā)生疏散和重組，引起細(xì)胞融合。該方法應(yīng)用分子質(zhì)量為400—6000的PEG溶液引起細(xì)胞的聚集和粘連，產(chǎn)生高頻率的細(xì)胞融合。融合的頻率和活力與所用PEG的分子質(zhì)量、濃度、作用時(shí)間、細(xì)胞的生理狀態(tài)與密度等有關(guān)?！緦?shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑】（一）儀器、用具刻度離心管、離心機(jī)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、水浴鍋、滴管、顯微鏡、燒杯、容量瓶、凹面載玻片、蓋玻片、酒精燈等。（二）材料雞紅細(xì)胞（三）試劑1．0.85%NaCl溶液2．GKN液：8.0gNaCl，0.4gKCl，1.77gNa2HPO4·2H2O，0.69gNaH2PO4·H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚紅，溶于1000ml重蒸水中。3．50%（W/V）PEG溶液1.取50gPEG（分子質(zhì)量=4000）放入100ml瓶中，高壓滅菌20分鐘。2.讓PEG冷卻至50～60℃，勿讓其凝固。3.加入50ml預(yù)熱至50℃的GKN液，混勻，置37℃4．Hanks原液(10×)：NaCl80.0gNa2HPO4·12H2O1.2ｇKCl4.0gKH2PO40.6ｇMgSO4·7H2O2.0ｇ葡萄糖10.0gCaCl21.4g1）稱取1.4g的CaCl2，融于30～50ml的重蒸水中。2）取1000ml的燒杯及容量瓶各一個(gè)，先放重蒸水800ml于燒杯中，然后按上述配方順序，逐一稱取藥品。必須在前一藥品完全溶解后，方可加入下一藥品，直到葡萄糖完全溶解后，再將已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至1000ml。5．Hanks液：Hanks原液100ml重蒸水896ml0.5%酚紅4ml配好的Hanks液，分裝包扎好貼上標(biāo)簽，經(jīng)過滅菌后，4℃保存。6．Janusgreen染液【方法與步驟】1.雞紅細(xì)胞的獲得：取新鮮雞血，迅速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制成抗凝全血。2.雞紅細(xì)胞儲(chǔ)備液的制備：在抗凝全血的試管中，加入4倍體積的0.85%NaCl溶液，制成紅細(xì)胞儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱內(nèi)可供一周內(nèi)使用。3.雞紅細(xì)胞懸液的制備：取雞紅細(xì)胞儲(chǔ)備液1ml，加入4ml0.85%NaCl溶液，混勻后，1200rpm離心5min，棄去上清液，再加入5ml0.85%NaCl溶液按上述條件離心一次。最后，棄去上清液，加入10ml的GKN溶液制成雞紅細(xì)胞懸液。4.計(jì)數(shù)：取0.5ml雞紅細(xì)胞懸液，加3.5ml的GKN溶液進(jìn)行稀釋，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。若細(xì)胞濃度過大，用GKN溶液稀釋至1107個(gè)/ml左右。5.雞紅細(xì)胞的收集：吸取1ml雞紅細(xì)胞懸液放入離心管中，加入4mlHanks液混勻，1000rpm離心5min。棄去上清液，用手指輕彈離心管底部，使沉淀的血細(xì)胞團(tuán)塊松散。6.PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合：吸取0.5ml37℃的50%PEG溶液，慢慢沿著離心管壁逐滴加入，邊加邊輕搖離心管，使PEG與細(xì)胞混勻，然后在37℃水浴中靜置2min7.終止PEG作用：緩慢加入5mlHanks液，輕輕吹打混勻，于37℃水浴中靜置5min。8.制備細(xì)胞懸液：用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)數(shù)次使細(xì)胞團(tuán)分散，1000rpm離心5min，使細(xì)胞完全沉降。棄去上清液，加Hanks液，再離心一次，棄多數(shù)上清，留少許溶液，混勻。9.染色和鏡檢：吸取細(xì)胞懸液，在凹面載玻片上滴一滴，加入Janusgreen染液混勻，染色3min后蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況。10.計(jì)算細(xì)胞融合率：細(xì)胞融合率是指在顯微鏡的視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞其細(xì)胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細(xì)胞（包括已融合細(xì)胞）的細(xì)胞核總數(shù)之比，通常以百分比表示。采用方法如下：在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，以融合細(xì)胞(含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。公式如下：【注意事項(xiàng)】1.本實(shí)驗(yàn)中，用0.85%NaCl液代替了Alsver液。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用Alsver液保存的紅細(xì)胞時(shí)間較短，而改用生理鹽水則明顯延長紅細(xì)胞的保存時(shí)間且不影響細(xì)胞融合率。2.高Ca2+濃度能夠提高細(xì)胞融合率。有些抗凝劑中含有和Ca2+結(jié)合的化合物，比如Alsver液中檸檬酸鈉的酸根與血液中的Ca2+形成難解離的可溶性絡(luò)合物，導(dǎo)