標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株鑒定操作規(guī)程

文獻(xiàn)類別質(zhì)量管理生效日期01月31日復(fù)評日期01月30日文獻(xiàn)名稱原則儲藏菌株鑒定操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量部1主題內(nèi)容與合用范疇本規(guī)程規(guī)定了原則儲藏菌株鑒定的操作辦法。本規(guī)程合用于對原則儲藏菌株的鑒定。2引用原則《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》、《中國藥典》及《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》現(xiàn)行版3職責(zé)微生物檢測質(zhì)檢員：負(fù)責(zé)按本規(guī)程對微生物原則菌株進(jìn)行鑒定。質(zhì)量部負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)按本規(guī)程對原則菌株的鑒定成果進(jìn)行審核。質(zhì)量部QA：負(fù)責(zé)監(jiān)督本規(guī)程的執(zhí)行；4程序采購的原則菌株需進(jìn)行純度和特性確實(shí)認(rèn)。4.1辦法增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)→純培養(yǎng)→確認(rèn)實(shí)驗(yàn)（菌落形態(tài)、革蘭氏染色、鏡檢、生化鑒定）4.1.1純培養(yǎng)用無菌接種環(huán)挑取待鑒定菌落/菌液至對應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基斜面或平板上培養(yǎng)，得到純化的單一菌落，做下列檢查。4.1.2革蘭氏染色、鏡檢4.1.2.1革蘭氏染色原理（1）革蘭氏染色法可將全部細(xì)菌分為兩大類：革蘭氏陽性細(xì)菌G+和革蘭氏陰性細(xì)菌G－。細(xì)菌對于革蘭氏染色的不同反映是由于它們細(xì)胞壁的成分和構(gòu)造不同而造成的。（2）革蘭氏陽性細(xì)菌G+：其細(xì)胞壁重要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀構(gòu)造構(gòu)成的，在染色過程中，當(dāng)用結(jié)晶紫溶液染色細(xì)胞后用脫色劑脫色時，引發(fā)細(xì)胞壁肽聚糖糖層網(wǎng)狀構(gòu)造中的孔徑縮小以至關(guān)閉，通透性減少，使結(jié)晶紫－碘復(fù)合物被保存在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此呈現(xiàn)深紫色。（3）革蘭氏陰性細(xì)菌G－：其細(xì)胞壁中肽聚糖含量低而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇脫色時，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫－碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，繼而又被復(fù)染液著色，因此呈現(xiàn)紅色。4.1.2.2革蘭氏染色液(1)草酸銨結(jié)晶紫溶液：結(jié)晶紫乙醇飽和液(結(jié)晶紫2g溶于20ml95%乙醇中)20mlL，1%草酸銨水溶液80ml將兩液混勻置24h后過濾即成。

(2)盧戈氏碘液：碘0.33g，碘化鉀0.66g，蒸餾水100ml。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸餾水至100ml即成。配成后貯于棕色瓶內(nèi)備用，如變?yōu)辄S色即不能使用。

(3)95%乙醇：用于脫色，脫色后可選用下列(4)復(fù)染即可。

(4)番紅溶液：番紅O2.5g，95%乙醇100ml，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶中，用時取20ml與80ml蒸餾水混勻即可。4.1.2.3染色過程（1）在干凈載玻片上滴上一滴滅菌純化水，用無菌接種環(huán)挑取一菌落均勻涂開，制成均勻涂片，涂布不適宜太厚或太薄，以免影響染色效果。（2）將上述涂片自然風(fēng)干或在酒精燈火焰上方快速來回2～3次微熱使之干燥、固定。以玻片背面接觸手背不燙為準(zhǔn)，否則可能使細(xì)菌形態(tài)變化，影響觀察成果。（3）涂片冷卻后，滴加1～2滴結(jié)晶紫溶液，保存約1分鐘，用冷水快速沖掉載玻片表面多出結(jié)晶紫溶液。（4）滴加1～2滴碘液，媒染約1分鐘，水洗，以濾紙吸干水分。（5）滴加95%乙醇，脫色20~30秒，至流出液無色(無紫色脫落為止)，立刻用冷水快速沖凈脫色酒精。（6）甩去多出水滴，滴加沙黃染液，復(fù)染約1分鐘后用冷水沖去沙黃染液，用濾紙吸干載玻片背部水份，將載玻片置空氣中晾干。（復(fù)染的時間不能太長，否則很容易將陽性菌染成陰性菌，且如果超出10秒復(fù)染液將干涸，影響鏡檢）（7）成果闡明：菌體呈紫色或藍(lán)紫色為革蘭氏陽性菌(G+)；菌體呈紅色，即為革蘭氏陰性菌(G－）。4.1.2.4鏡檢在載玻片的菌膜上滴一滴香柏油，用顯微鏡的油鏡觀察標(biāo)本。菌體呈紅色為革蘭氏陰性菌G-，菌體呈藍(lán)紫色為革蘭氏陽性菌G+。同時觀察菌體的狀態(tài)、排列，分辯并描述是球菌、桿菌、弧菌、放線菌以及菌體大小。4.2菌株鑒定辦法4.2.1銅綠假單胞菌4.2.1.1純培養(yǎng)用接種環(huán)沾取菌落/菌液于胰酪大豆胨瓊脂斜面或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時后，做下列檢查。4.2.1.2形態(tài)學(xué)鑒定4.2.1.2.1菌落形態(tài)：菌體扁平、呈灰白色、無定形、邊沿不齊周邊擴(kuò)散，表面濕潤，周邊有藍(lán)綠色素。4.2.1.2.2革蘭氏染色及鏡檢革蘭氏染色（見4.1.2.3）、鏡檢（4.1.2.4）革蘭氏染色鑒定成果：菌體呈紅色，革蘭氏陰性菌（G－）。鏡檢鑒定成果：革蘭氏陰性桿菌，為短鏈狀的排列。4.2.1.3生化特性鑒定4.2.1.3.1觸酶實(shí)驗(yàn)（1）試劑：3%過氧化氫溶液（2）辦法與成果：使用接種環(huán)大量挑取TSA平板上的新鮮菌苔至3%過氧化氫溶液安剖管中，觀察成果。立刻產(chǎn)生大量氣泡為陽性，否則為陰性。4.2.1.3.2氧化酶實(shí)驗(yàn)用鑷子夾住氧化酶試紙片，使用無菌吸管吸取純水滴加至紙片1～2滴使?jié)駶?，用鑷子夾著紙片在新鮮平板上蘸取大量新鮮菌苔，1分鐘內(nèi)觀察成果。該實(shí)驗(yàn)應(yīng)在劃線TSA平板后的次日立刻操作，確保使用的是新鮮菌苔。試紙變成藍(lán)色為陽性，否則為陰性。4.2.1.3.3綠膿菌素（Pyoeyanin）實(shí)驗(yàn)（1）培養(yǎng)基：綠膿菌素測定瓊脂斜面PDP（2）辦法與成果：使用接種環(huán)挑取TSA平板上的新鮮菌苔劃線接種于綠膿菌素測定瓊脂斜面，30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后菌苔呈綠色或藍(lán)綠色為陽性，否則為陰性。4.2.1.3.4明膠液化實(shí)驗(yàn)（1）培養(yǎng)基：明膠生化管（2）試劑：比濁管，生理鹽水（3）辦法與成果：使用接種環(huán)挑取TSA平板上的新鮮菌苔至生理鹽水中，使菌液濁度與比濁管相似（比濁管使用前應(yīng)充足震蕩混勻），制成菌懸液。用無菌吸管，于明膠生化管中滴加1～2滴上述菌液，加塞，30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時后放入2～8℃冰箱1小時后觀察成果。培養(yǎng)基呈流體狀，不是固體為陽性，否則為陰性。4.2.1.3.5葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（1）培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵管（2）辦法與成果：用無菌吸管吸取4.2.1.3.4中的菌懸液，滴加1～2滴于葡萄糖發(fā)酵管中，30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時后觀察成果。培養(yǎng)基呈綠色或藍(lán)色，為陰性，否則為陽性。4.2.1.4成果判斷純培養(yǎng)物的菌落形態(tài)均一且符合形態(tài)學(xué)特性，×100油鏡下觀察呈紅色短鏈狀桿菌，觸酶實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、綠膿菌素實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)皆為陽性，葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)為陰性者，即可鑒定為銅綠假單胞菌。4.2.2金黃色葡萄球菌4.2.2.1純培養(yǎng)用接種環(huán)沾取菌落/菌液于胰酪大豆胨瓊脂斜面或胰酪大豆胨瓊脂平板上劃線，置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時后，做下列檢查。4.2.2.2形態(tài)學(xué)鑒定4.2.2.2.1菌落形態(tài)：菌落呈金黃色，圓形凸起，邊沿整潔，外圍有黃色環(huán)。4.2.2.2.2革蘭氏染色及鏡檢革蘭氏染色（見4.1.2.3）、鏡檢（4.1.2.4）；革蘭氏染色鑒定成果：菌體呈紫色，為革蘭氏陽性菌（G+）。鏡檢鑒定成果：革蘭氏陽性球菌，無芽孢，呈不規(guī)則葡萄狀。4.2.2.3生化特性鑒定4.2.2.3.1菌懸液的制備使用接種環(huán)挑取TSA平板上的新鮮菌苔至生理鹽水中，搖勻，使菌液濁度與比濁管相似（比濁管使用前應(yīng)充足震蕩混勻），制成菌懸液。4.2.2.3.2觸酶實(shí)驗(yàn)（1）試劑：3%過氧化氫溶液（2）辦法與成果：使用接種環(huán)大量挑取TSA平板上的新鮮菌苔至3%過氧化氫溶液安剖管中，觀察成果。立刻產(chǎn)生大量氣泡為陽性，否則為陰性。4.2.2.3.3甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（1）培養(yǎng)基：甘露醇發(fā)酵管（2）辦法與成果：用無菌吸管吸取4.2.2.3.1中的菌懸液，滴加1～2滴于甘露醇發(fā)酵管中，33～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20~24小時。培養(yǎng)基變黃色為陽性，否則為陰性。4.2.2.3.4蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（1）培養(yǎng)基：蔗糖發(fā)酵管（2）辦法與成果：用無菌吸管吸取4.2.2.3.1中的菌懸液，滴加1～2滴于蔗糖發(fā)酵管，33～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20~24小時。培養(yǎng)基變黃色為陽性，否則為陰性。4.2.2.3.5血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)（1）試劑：凍干兔血漿（2）培養(yǎng)基：腦心浸出液肉湯（BHI）（3）辦法與成果：用無菌吸管吸取4.2.2.3.1中的菌懸液，滴加1～2滴于腦心浸出液肉湯（BHI）33～35℃培養(yǎng)20～24小時，肉湯應(yīng)渾濁。使用無菌吸管，將上述BHI的細(xì)菌培養(yǎng)液全部加入至兔血漿管中，使兔血漿凍干粉溶解，33～35℃培養(yǎng)4小時。血漿發(fā)生凝固，呈半固體狀為陽性，否則為陰性。4.2.2.4成果判斷純培養(yǎng)物的菌落形態(tài)均一且符合形態(tài)學(xué)特性，×100油鏡下觀察呈紫色球菌，觸酶實(shí)驗(yàn)、甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)皆為陽性者，即鑒定為金黃色葡萄球菌。4.2.3大腸埃希菌（B款）4.2.3.1純培養(yǎng)用接種環(huán)沾取菌落/菌液于胰酪大豆胨斜面瓊脂或胰酪大豆胨瓊脂平板上劃線，置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，做下列檢查。4.2.3.2形態(tài)學(xué)鑒定4.2.3.2.1菌落形態(tài)：菌落半透明白色，表面光滑濕潤。4.2.3.2.2革蘭氏染色及鏡檢革蘭氏染色（見4.1.2.3）、鏡檢（4.1.2.4）革蘭氏染色鑒定成果：菌體呈紅色為革蘭氏陰性菌（G－）。鏡檢鑒定成果：革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢。4.2.3.3生化鑒定4.2.3.3.1糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)從平板上挑取純培養(yǎng)物菌落無菌接種于乳糖發(fā)酵管中，30～35℃培養(yǎng)24～48小時，或幾小時甚至更長時間培養(yǎng)。產(chǎn)酸：培養(yǎng)基中批示劑呈酸性反映變黃色，“+”；產(chǎn)氣：培養(yǎng)基倒置的杜氏小管有氣泡；固體培養(yǎng)基可出現(xiàn)開裂等現(xiàn)象，“+”。4.2.3.3.2靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)（I）將純培養(yǎng)物接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)24～48小時，滴加柯凡克試劑數(shù)滴于培養(yǎng)液面，輕輕搖動。陽性反映：在培養(yǎng)基上部有一紅色環(huán)陰性反映：黃色、桔黃色或棕色。4.2.3.3.3甲基紅實(shí)驗(yàn)（M）（1）試劑：甲基紅0.1g，95%乙醇300ml。將甲基紅研磨溶解于乙醇中，再加蒸餾水至500ml制成。（2）培養(yǎng)基：磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（3）辦法與成果：將純培養(yǎng)物接種于上述培養(yǎng)基中，經(jīng)36±1℃培養(yǎng)48小時，于管內(nèi)加入甲基紅批示劑數(shù)滴，立刻觀察成果，呈紅色者為陽性，呈黃色者為陰性。4.2.3.3.4乙酰甲基甲醇生成實(shí)驗(yàn)（V-P）將純培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水中，36±1℃培養(yǎng)48±2小時，于2ml培養(yǎng)液先加入甲液1ml（6%α奈酚酒精溶液）混勻，再加乙液（40%KOH溶液）0.4ml，充足搖動，如4h內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，無紅色反（黃色或銅色）為陰性。4.2.3.3.5枸櫞酸鹽運(yùn)用實(shí)驗(yàn)（C）將純培養(yǎng)物接種到枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，于36±1℃培養(yǎng)48～72小時。斜面培養(yǎng)基上有菌生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽性反映；培養(yǎng)基無菌生長，斜面仍為綠色為陰性反映。4.2.3.4成果判斷純培養(yǎng)物的菌落形態(tài)均一且符合形態(tài)學(xué)特性，×100油鏡下觀察呈紅色短桿狀，為革蘭氏陰性菌，乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，IMViC實(shí)驗(yàn)＋＋－－或－＋－－，即鑒定為大腸埃希菌。4.2.4枯草芽孢桿菌4.2.4.1純培養(yǎng)用接種環(huán)沾取菌落/菌液于胰酪大豆胨瓊脂斜面或胰酪大豆胨瓊脂平板上劃線，置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時后，做下列檢查。4.2.4.2形態(tài)學(xué)鑒定4.2.4.2.1菌落形態(tài)：菌落淺褐色、不規(guī)則、扁平，干燥有褶皺。4.2.4.2.2革蘭氏染色及鏡檢革蘭氏染色（見4.1.2.3）、鏡檢（4.1.2.4）革蘭氏染色鑒定成果：菌體呈紫色或藍(lán)紫色，為革蘭氏陽性菌（G+）鏡檢鑒定成果：紫色或藍(lán)紫色桿菌。4.2.4.3生化鑒定4.2.4.3.1菌懸液的制備使用接種環(huán)挑取TSA平板上的新鮮菌苔至生理鹽水中，搖勻，使菌液濁度與比濁管相似（比濁管使用前應(yīng)充足震蕩混勻），制成菌懸液。4.2.4.3.2觸酶實(shí)驗(yàn)（1）試劑：3%過氧化氫溶液（2）辦法與成果：使用接種環(huán)大量挑取TSA平板上的新鮮菌苔至3%過氧化氫溶液管中，觀察成果。立刻產(chǎn)生大量氣泡為陽性，否則為陰性。4.2.4.3.3硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)（1）試劑：硝酸鹽還原試劑（甲液和乙液）（2）培養(yǎng)基：硝酸鹽肉湯（3）辦法與成果：用無菌吸管吸取4.2.4.3.1中的菌懸液，滴加1～2滴于硝酸鹽肉湯中，30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時或更長時間后，向試管內(nèi)滴加硝酸鹽還原試劑甲液、乙液各3滴，觀察成果。試管中液體呈橘紅色或紅色為陽性，否則為陰性。4.2.4.3.4甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（1）培養(yǎng)基：甘露醇發(fā)酵管（2）辦法與成果：用無菌吸管吸取4.2.4.3.1中的菌懸液，滴加1～2滴于甘露醇發(fā)酵管，30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48小時，觀察現(xiàn)象。培養(yǎng)基變黃色或黃綠色為陽性，否則為陰性。4.2.4.3.5V-P實(shí)驗(yàn)（1）試劑：V-P試劑（甲液和乙液）（2）培養(yǎng)基：緩沖葡萄糖蛋白胨水（3）辦法與成果：用無菌吸管吸取4.2.4.3.1中的菌懸液，滴加1～2滴于緩沖葡萄糖蛋白胨水中，30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時或更長時間后，滴加V-P試劑甲液6滴。乙液2滴，30～35℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)基變紅色為陽性反映，否則為陰性。4.2.4.3.6阿拉伯糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（1）培養(yǎng)基：阿拉伯糖發(fā)酵管（2）辦法與成果：用無菌吸管吸取4.2.4.3.1中的菌懸液，滴加1～2滴于阿拉伯糖發(fā)酵管，30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48小時，觀察現(xiàn)象。培養(yǎng)基變黃色或黃綠色為陽性，否則為陰性。4.2.4.3.7精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)（1）試劑：無菌液體石蠟（2）培養(yǎng)基：精氨酸脫羧酶肉湯，精氨酸脫羧酶對照液（3）辦法與成果：用無菌吸管吸取4.2.4.3.1中的菌懸液，分別滴加1～2滴于精氨酸脫羧酶肉湯和精氨酸脫羧酶對照液中，接種后覆蓋4～6滴液體石蠟30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，精氨酸脫羧酶肉湯管和精氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)對照管均呈黃色或淺黃色，為陰性。4.2.4.4成果判斷純培養(yǎng)物的菌落形態(tài)均一且符合形態(tài)學(xué)特性，×100油鏡下觀察呈紫色或藍(lán)紫色桿菌；觸酶實(shí)驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)陽性，甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽性，V-P實(shí)驗(yàn)陽性，阿拉伯糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽性，精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)陰性，則鑒定為枯草芽孢桿菌。4.2.5白色念珠菌4.2.5.1純培養(yǎng)用接種環(huán)沾取菌落/菌液于沙氏葡萄糖瓊脂斜面或沙氏葡萄糖瓊脂平板上劃線，置于20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3天后，做下列檢查。4.2.5.2形態(tài)學(xué)鑒定4.2.5.2.1菌落形態(tài)：菌落為乳白色，表面光滑。4.2.5.2.2顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)挑選2~3個菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，25~30℃培養(yǎng)18~24小時（必要時延長至72小時）。再挑取平板上生