瑞香狼毒花粉浸提液對(duì)花粉萌發(fā)和種子結(jié)實(shí)的化感作用

瑞香狼毒花粉浸提液對(duì)花粉萌發(fā)和種子結(jié)實(shí)的化感作用

花粉轉(zhuǎn)化是一種以花粉為中心的現(xiàn)象?；ǚ蹖?duì)其他種類的花粉、花粉管的生長(zhǎng)、花柱、胚胎、發(fā)芽和生長(zhǎng)有負(fù)效應(yīng)。目前,雖然發(fā)現(xiàn)了一些具有花粉化感作用的物種,比如農(nóng)作物,像玉米(ZeamaysL.var.chalqui?ocónicoHernández);野草,像貓尾草(PhleumpretenseL.)、橘色山柳蘭(HieraciumaurantiacumL.)、黃色山柳蘭(H.pratense)和銀膠菊(PartheniumhysterophorusL.)。瑞香狼毒隸屬于瑞香科狼毒屬。它主要生長(zhǎng)于海拔1000—4200m,干燥向陽山坡以及高山、亞高山草地、灌叢或松林下。在我國(guó),它廣泛分布于西北、西南、東北、華北各省,以及臺(tái)灣省等地,主要分布于青海省的天然草地,四川省的甘孜州、阿壩州天然草場(chǎng)以及涼山州的西北部的高山、亞高山草甸區(qū)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)瑞香狼毒的研究很多,但集中在藥用價(jià)值以及種群分布格局和散布機(jī)制上,而對(duì)其生態(tài)學(xué)效應(yīng)的研究不多。狼毒是一種具有很強(qiáng)入侵性的毒草。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前僅在中國(guó)西部就有133萬hm2。它已經(jīng)成為我國(guó)危害最嚴(yán)重的草地雜草之一。目前在青藏高原東部高寒草甸上狼毒危害比較嚴(yán)重,大面積可食的禾草和嵩草被狼毒取代。而且,在過度放牧的背景下,狼毒危害面積還在不斷蔓延。狼毒蔓延將產(chǎn)生怎樣的生態(tài)學(xué)效應(yīng),值得研究。狼毒的花較大,花朵鮮艷,能夠吸引大量傳粉昆蟲;在青藏高原東部的高山草甸,狼毒花期從每年的6—8月份,花期較長(zhǎng);當(dāng)?shù)匚锓N豐富,與狼毒同花期的物種很多;狼毒的頭狀花序的每個(gè)小花都能產(chǎn)生大量花粉,這些花粉對(duì)人眼、鼻、喉有較強(qiáng)烈而持久的辛辣性刺激。同時(shí),據(jù)觀察,在青藏高原東部的高山草甸,存在豐富、大量的傳粉昆蟲,種間的花粉傳播行為頻繁發(fā)生。假設(shè)狼毒可能通過花粉化感作用抑制同花期的其它物種的花粉萌發(fā)和種子結(jié)實(shí),進(jìn)而對(duì)其它物種種群的有性繁殖產(chǎn)生負(fù)作用。1學(xué)習(xí)方法1.1亞高山草地土pall研究地點(diǎn)位于四川省松潘縣尕米寺附近(北緯32°53′,東經(jīng)103°40′,海拔3190m)。研究地年均溫2.8℃;最冷月1月份均溫-7.6℃,最熱月7月份均溫9.7℃。當(dāng)?shù)貨]有絕對(duì)無霜期。每年的日照時(shí)數(shù)平均為1827.5h。0℃以上積溫為428.6℃。年均降水量717.7mm,其中72%的降水分布在6—8月份。整個(gè)研究區(qū)域是典型的高寒草甸,嵩草屬(Kobresiaspp.)和早熟禾屬(Poaspp.)的物種占優(yōu)勢(shì)。其它的常見物種包括,草本:圓穗蓼(PolygonummacrophyllumD.Donvar.Macrophyllum,),秦艽(GentianamacrophyllaPall.var.fetissowii),濕生扁蕾(Gentianopsispaludosa(Hook.f.)Mavar.paludosa),鱗葉龍膽(GentianasquarrosaLedeb.),橢圓葉花錨(HaleniaellipticaD.Donvar.elliptica),藍(lán)鐘花(CyananthushookeriC.B.Cl.var.grandiflorusMarq.),小米草(EuphrasiapectinataTen.),川西翠雀花(DelphiniumtongolenseFranch.),高原毛茛(Ranunculustanguticus(Maxim.)Ovcz.var.tanguticus)和鵝絨委陵菜(PotentillaanserinaL.var.anserina),高山龍膽(GentianaalgidaPall.),小柴胡(BuplerumtenueBuch-Han.exD.Don),條葉銀蓮花(Anemonetrullifoliavar.linearis(Bruhl)Hand.-Mazz.),紅花芹(Tongoloadunnii(Boiss.)Wolff),矩鐮夾苜蓿(Medicagoarchiducis-nicolai)和甘青老鸛草(GeraniumpylzowianumMaxim);灌木:蒙古繡線菊(SpiraeamongolicaMaxim.var.mongolica),平枝栒子(CotoneasterhorizontalisDecne)。土壤屬于亞高山草甸土,其中含有19%粘粒,66%粉粒和15%沙粒。2007年6月初,在研究地進(jìn)行群落調(diào)查。研究地單位面積上的物種密度見表1。同時(shí),觀察狼毒與其它物種間的傳粉行為。1.2花粉浸提液及培養(yǎng)基的制備室內(nèi)花粉萌發(fā)試驗(yàn)物種選擇:選擇6種研究地主要物種進(jìn)行花粉萌發(fā)室內(nèi)研究,包括秦艽、濕生扁蕾、鱗葉龍膽、橢圓葉花錨、高原毛茛和鵝絨委陵菜。同時(shí),用狼毒花粉浸提液對(duì)自身花粉進(jìn)行萌發(fā)測(cè)試?；ǚ勖劝l(fā)培養(yǎng)基的制備:培養(yǎng)基是均一化的1%的乳酸瓊脂以及100μg/gH3BO4、300μg/gCaCL2和100μg/gKH2PO4的混合物?；靹蚝蟮呐囵B(yǎng)基用0.1molL-1NaOH調(diào)節(jié)pH到5.8。培養(yǎng)基高壓滅菌消毒后密封保存在4℃下備用。此培養(yǎng)基在野外較高溫度時(shí)呈液態(tài),在20℃室溫下凝固成固態(tài)。它能夠提高潛在的花粉化感物質(zhì)的均質(zhì)性,同時(shí)不影響花粉的萌發(fā),并能通過為細(xì)胞膜內(nèi)磷脂提供碳水化合物減少花粉的失活。狼毒花粉浸提液的制備:從野外采集足夠數(shù)量的成熟的狼毒花,盡快用4℃的冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。準(zhǔn)確稱取0.0001g狼毒花粉,稀釋,在200(20倍物鏡×10倍目鏡)顯微鏡下計(jì)數(shù)。稱量25000000個(gè)狼毒花粉,置于100mL容量瓶中,加蒸餾水定容到100mL,制成100mL250000個(gè)花粉/mL的貯存溶液。在4℃下浸提12h,使之通過20μm濾網(wǎng)以濾去花粉。分別取上述濾液0.4,4,8,12,20,40,80mL,與培養(yǎng)基溶液一起加于1L容量瓶中,制成0.1,1,2,3,5,10,20個(gè)花粉/μL的花粉浸提——培養(yǎng)基混合液備用。保存于4℃下。用培養(yǎng)基對(duì)照。對(duì)同花期其它物種花粉萌發(fā)的影響試驗(yàn):把上述不同濃度的花粉浸提——培養(yǎng)基混合液加到經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)皿中,溶液混勻攤平至小于1mm厚,封口膜密封,用4℃冰盒帶至野外。每個(gè)研究物種每個(gè)濃度設(shè)置8個(gè)重復(fù),即8個(gè)表面皿(考慮到菌類污染容易發(fā)生;若無污染,只觀察5個(gè)重復(fù))。在野外,取受試物種的花粉,加入到上述培養(yǎng)皿中,并盡可能使之分散均勻。立即帶回實(shí)驗(yàn)室。在室溫20℃左右萌發(fā)8h;加入乙醇,阻止花粉管繼續(xù)伸長(zhǎng)。萌發(fā)期間不斷觀察,去除被微生物污染的培養(yǎng)皿(由于細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)速度快于花粉萌發(fā),可以區(qū)分兩者)。用200倍的顯微鏡觀察,估計(jì)萌發(fā)的花粉(花粉管完整,延長(zhǎng)至超過花粉直徑即算萌發(fā))的百比例。1.3種子結(jié)實(shí)試驗(yàn)野外種子結(jié)實(shí)率試驗(yàn)物種選擇:選擇4個(gè)物種進(jìn)行研究,包括秦艽、濕生扁蕾、鱗葉龍膽和橢圓葉花錨。對(duì)同花期其它物種種子結(jié)實(shí)率的影響試驗(yàn):應(yīng)用貯存液配制濃度分別為1,3,5,10,20個(gè)花粉/μL狼毒花粉浸提液,加到其它物種柱頭上進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí),設(shè)置兩個(gè)對(duì)照組,一個(gè)是以蒸餾水作對(duì)照組(用0.1molL-1HCl調(diào)節(jié)pH至5.8),一個(gè)以完全不作處理作對(duì)照組。浸提液和蒸餾水用4℃的冰盒帶至野外。在7月中旬狼毒盛花期進(jìn)行試驗(yàn)。在花柱上施加浸提液或蒸餾水之前1—3d,用罩袋(可阻止花粉傳播)把花與外界隔離開。在上述樣地設(shè)置下隨機(jī)選取50個(gè)樣方;在每個(gè)樣方內(nèi),每個(gè)物種每個(gè)濃度隨機(jī)選1個(gè)植株,每個(gè)植株的花序上選1—10朵花的花柱;去掉該植株上其它的花或花序,保證每個(gè)植株上有相等數(shù)量的花或花序。取下罩袋后,用針頭在柱頭上施加半滴狼毒花粉浸提液。1h后,用小刷子在受試物種的柱頭上涂抹自種花粉,保證足夠多得自種花粉。重新安置罩袋;在花開過之后,移去罩袋。在500m外的無狼毒樣地上,用蒸餾水做類似試驗(yàn),并作無任何處理對(duì)照。種子成熟后收集、干燥和計(jì)數(shù)。用蒸餾水的試驗(yàn)中,各物種的種子結(jié)實(shí)率是以蒸餾水處理中的種子結(jié)實(shí)數(shù)除以無任何對(duì)照處理中平均的種子結(jié)實(shí)數(shù);用狼毒花粉浸提液的試驗(yàn)中,各物種的種子結(jié)實(shí)率是以一系列狼毒花粉浸提液處理中的種子結(jié)實(shí)數(shù)除以蒸餾水處理中平均的種子結(jié)實(shí)數(shù)。2結(jié)果2.1狼毒花粉浸提液濃度對(duì)花粉萌發(fā)的影響研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),狼毒花粉對(duì)自身花粉的萌發(fā)沒有顯著影響(圖1)。其它6個(gè)主要物種(包括秦艽、濕生扁蕾、鱗葉龍膽、橢圓葉花錨、高原毛茛和鵝絨委陵菜)的花粉萌發(fā)率均隨狼毒花粉浸提液濃度的增加而呈非線性降低,5個(gè)狼毒花粉浸提液對(duì)其它物種花粉萌發(fā)有顯著抑制作用(圖2a—j)。它們的50%花粉萌發(fā)抑制所需的狼毒花粉浸提液濃度數(shù)據(jù)見表2。50%花粉萌發(fā)抑制需要最低浸提液濃度的物種是橢圓葉花錨,需0.7個(gè)μL-1;最高的是高原毛茛,需3.7個(gè)μL-1。除了高原毛茛之外,多數(shù)物種在3個(gè)μL-1濃度時(shí),就有50%的花粉不能萌發(fā)。2.2狼毒花粉浸提液對(duì)種子粘結(jié)的影響設(shè)置的2個(gè)對(duì)照組,即不作任何處理對(duì)照組和在柱頭上加入蒸餾水的對(duì)照組,的種子結(jié)實(shí)率稍有不同(設(shè)定不作任何處理對(duì)照組種子結(jié)實(shí)率為100%)(表3)。其它4個(gè)主要物種(包括秦艽、濕生扁蕾、鱗葉龍膽和橢圓葉花錨)的種子結(jié)實(shí)率均隨狼毒花粉浸提液濃度的增加而呈非線性降低(以不作任何處理為對(duì)照組)(圖3a—f)。1個(gè)狼毒花粉的浸提液通常不會(huì)影響其它物質(zhì)的種子結(jié)實(shí);在有5個(gè)狼毒花粉時(shí),受試4個(gè)物種種子結(jié)實(shí)率降低40%到65%。3討論3.1從四、有效同時(shí)進(jìn)行圖書館和受試物的花粉化感后,各有側(cè)重、分狼毒花粉浸提液沒有對(duì)自身的花粉萌發(fā)產(chǎn)生負(fù)影響(圖1)。一般來說,種群不會(huì)產(chǎn)生干擾自身有性繁殖的特質(zhì)。這與土壤中的情況不太一樣。在土壤中,自毒是一種影響種間競(jìng)爭(zhēng)的常見的化感作用方式。狼毒花粉對(duì)自毒效應(yīng)的缺乏可能表明,在狼毒花粉內(nèi)可能含有抗御花粉化感物質(zhì)的成分存在。50%花粉萌發(fā)抑制需要最低浸提液濃度的物種是橢圓葉花錨,只需0.7個(gè)μL-1;最高的是高原毛茛,需要3.7個(gè)μL-1(表2)。這可能暗示橢圓葉花錨的花粉萌發(fā)更容易受到狼毒花粉化感物質(zhì)的抑制,而高原毛茛正好相反。除了高原毛茛之外,多數(shù)物種在3個(gè)μL-1濃度時(shí),就有50%的花粉不能萌發(fā)(表2),表明3個(gè)狼毒花粉的浸提液即有較強(qiáng)的花粉萌發(fā)抑制作用。受試的6個(gè)物種的花粉萌發(fā)率均隨狼毒花粉浸提液濃度的增加呈非線性降低(圖2a—f)。這種非線性曲線被認(rèn)為是花粉化感的特征曲線。除了花粉化感之外,還有一些其它的因素也可以影響花粉的萌發(fā)率,比如培養(yǎng)基的毒性、不適當(dāng)?shù)慕?rùn)和滲透壓、缺氧和極端的pH,它們可能導(dǎo)致花粉和花粉管的破裂。而花粉化感作用允許花粉浸潤(rùn)并保持完整,但卻抑制花粉的萌發(fā)。同很多化感物質(zhì)一樣,花粉化感物質(zhì)導(dǎo)致非線性降低。而其它因素,比如pH和其它一些因素都將導(dǎo)致花粉萌發(fā)率的線性降低。花粉質(zhì)量可能隨環(huán)境條件的變化而改變,尤其是對(duì)那些花期較長(zhǎng)的物種,花粉質(zhì)量在整個(gè)花期可能會(huì)發(fā)生較大變化。如果考慮到狼毒花期較長(zhǎng),那么在整個(gè)花期,狼毒花粉質(zhì)量可能發(fā)生較大變化,進(jìn)而對(duì)其它物種花粉萌發(fā)的影響可能不同。因此有必要進(jìn)一步研究狼毒花粉在不同年份和不同開花時(shí)間的影響。同時(shí),不同種群的狼毒間花粉質(zhì)量也可能存在顯著差異,因此有必要進(jìn)行跨地區(qū)的研究。在本研究中,狼毒花粉是從種群水平上,即不同狼毒植株上,采集、試驗(yàn)的;受試物種的花粉也是在種群水平上取得的。因此,狼毒種群內(nèi)個(gè)體間花粉化感的差異,或者受試物種個(gè)體間對(duì)花粉化感的相應(yīng)差異還有待研究。此外,在實(shí)驗(yàn)室中用狼毒花粉浸提液作的研究與實(shí)際的野外條件有兩方面差別:一是在柱頭上,狼毒花粉產(chǎn)生的是一個(gè)異質(zhì)性的環(huán)境;二是即使狼毒花粉散落在柱頭上,仍然可能沒有溶液將其中的化感物質(zhì)傳遞到柱頭上。3.2花粉浸提液對(duì)種子結(jié)實(shí)的影響研究發(fā)現(xiàn),與不作任何處理對(duì)照組相比,加入蒸餾水對(duì)照組種子結(jié)實(shí)率略有下降,可見加入蒸餾水對(duì)種子結(jié)實(shí)有一定影響,但是影響不大(表3)。在有5個(gè)狼毒花粉時(shí),受試4個(gè)物種種子結(jié)實(shí)率降低40%到65%(圖3a—d)。狼毒的花粉浸提液與真正的花粉的效果肯定不會(huì)完全一致,但是,已有的研究表明,真正花粉的化感效果強(qiáng)于花粉浸提液,所以5個(gè)狼毒花粉的浸提液可能大大降低種子的結(jié)實(shí)率。1個(gè)狼毒花粉的浸提液通常不會(huì)影響其它物質(zhì)的種子結(jié)實(shí)(圖3a—d)。這與實(shí)驗(yàn)室中的結(jié)果有所不同(圖2a—f),實(shí)驗(yàn)室中,相同的花粉浸提液的效果更明顯。已有研究發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)室中花粉浸提液的毒性和對(duì)有性繁殖的影響更大。本文研究結(jié)果與之相似。與實(shí)驗(yàn)室中花粉萌發(fā)率降低的非線性曲線相似,種子結(jié)實(shí)率降低的曲線也是非線性的(圖3a—f)。在以異種花粉散布為媒介的各種作用中,梗塞可能是最容易與花粉化感作用相區(qū)別的。是否梗塞是一種常見現(xiàn)象有待證明,至少在本研究中,種子結(jié)實(shí)率的降低不是由于狼毒花粉的梗塞作用造成的,因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中應(yīng)用的是狼毒花粉的浸提液。而且,即使應(yīng)用真正的狼毒花粉到其它物種的柱頭上,梗塞現(xiàn)象導(dǎo)致的種子結(jié)實(shí)率的降低也不應(yīng)該是非線性的。因?yàn)楣Ｈ麘?yīng)該是一對(duì)一的影響,即一?；ǚ蹖?dǎo)致一個(gè)種子不能結(jié)實(shí);梗塞不會(huì)導(dǎo)致花粉萌發(fā)率和種子結(jié)實(shí)率的非線性降低。而花粉化感則不同:一粒狼毒花粉可以抑制超過一粒受試物種花粉的萌發(fā),它的影響范圍也超過一粒受試物種花粉的大小。因此,種子結(jié)實(shí)率的非線性降低說明有花粉作用存在。這種非線性可能是花粉化感作用的特征曲線。通過實(shí)驗(yàn)室的花粉萌發(fā)試驗(yàn)證明