oxldl-ab的i標(biāo)記及體外穩(wěn)定性和活性評(píng)價(jià)

oxldl-ab的i標(biāo)記及體外穩(wěn)定性和活性評(píng)價(jià)

動(dòng)脈硬化（as）是導(dǎo)致各種心腦血管疾病的主要原因。它是在某些異常情況下,血管內(nèi)皮發(fā)生損傷,刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子,血漿中的低密度脂蛋白(LowdensityLipoprotein,LDL)載帶膽固醇經(jīng)過損傷處時(shí),被炎癥因子等氧化修飾成氧化低密度脂蛋白(OxidizedLowdensityLipoprotein,OxLDL),巨噬細(xì)胞通過清道夫途徑識(shí)別并吞噬OxLDL,并吸收其載帶的膽固醇而膨脹形成泡沫細(xì)胞,并漸漸積累形成粥樣斑塊;OxLDL是AS全病程中重要的標(biāo)志物,并且與高血壓等疾病密切相關(guān)。OxLDL作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的自身抗體是氧化低密度脂蛋白單克隆抗體(AntioxidizedLowdensityLipoproteinMonoclonalAntibody,OxLDL-Ab)。根據(jù)125I標(biāo)記的單克隆抗體與抗原物質(zhì)定量反應(yīng),可以使體內(nèi)存在的抗原物質(zhì)得以常規(guī)化檢測(cè),這對(duì)受檢者的臨床診斷和治療有實(shí)際意義。目前,國外已有OxLDL-Ab的酶聯(lián)免疫試劑盒出售,國內(nèi)已有OxLDL半定量試紙專利,但尚無OxLDL-Ab放免試劑盒的研究報(bào)道。鑒于放免試劑盒具有結(jié)果可靠、簡(jiǎn)便易行、成本低廉并具有高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn),本研究擬采用放射性核素125I標(biāo)記抗OxLDL-Ab,評(píng)價(jià)125I-OxLDL-Ab與OxLDL結(jié)合的活性,為抗OxLDL-Ab用于AS體外診斷放免試劑盒的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1聚天平pd-10柱型GAMMAC12γ計(jì)數(shù)器:美國DPC公司產(chǎn)品;RM-905a型活度計(jì):中國計(jì)量科學(xué)研究院產(chǎn)品;AR2130型電子天平:美國OHAUS公司產(chǎn)品;單道可調(diào)移液器:美國Eppendorf公司產(chǎn)品;PD-10柱:瑞典AmershamBioscience公司產(chǎn)品;WhatmanNo.1試紙:英國Whatman公司產(chǎn)品。1.2小鼠鑰孔蟲基因OxLDL-Ab:1.228g/L,成都華神生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供;牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA):北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Na125I溶液:放射性濃度為13TBq/L,美國PerkinElmerLifeScience公司產(chǎn)品;小鼠鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(MouseKeyholeLimpetHemocyanin,KLH):SigmaAldrich公司產(chǎn)品。其它化學(xué)試劑均為分析純,購自北京化學(xué)試劑公司。1.3標(biāo)記的純化和鑒定采用Iodogen法進(jìn)行標(biāo)記。將81μLOxLDL-Ab的PBS溶液(0.2mol/L,pH7.4,含40μgOxLDL-Ab)置于Iodogen管中,加入9.25MBqNa125I溶液,用0.2mol/L、pH7.4的磷酸緩沖液(PB)調(diào)反應(yīng)體積至200μL,振搖反應(yīng)8min,移出反應(yīng)液,停止反應(yīng)。用PD-10柱層析法對(duì)標(biāo)記液進(jìn)行純化。以0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液為淋洗液,流速控制在每分鐘約6滴,按每管0.2mL收集洗脫液,并測(cè)量放射性活度。采用紙色譜法測(cè)定125I-OxLDL-Ab的標(biāo)記率和放化純度。分別將純化前的反應(yīng)液和純化后的產(chǎn)物用WhatmanNo.1試紙測(cè)定,以V(甲醇)∶V(水)=85∶15溶液為展開劑。1.41鹽水與人血清三種生物體系放化純度的測(cè)定將400μL放化純度為96%、放射性比活度為24TBq/g的125I-OxLDL-Ab,分別置于生理鹽水、含2%BSA的生理鹽水和人血清3種體系,各體系一式3份,分別置于4、10和37℃存放,分別于放置后1、2、18h和1、2、3、4、6、7d取樣,用紙色譜法測(cè)其放化純度。1.5標(biāo)準(zhǔn)樣的制備125I-OxLDL-Ab與其抗原KLH的結(jié)合實(shí)驗(yàn)采用96孔板法。用100μL0.05g/LKLH包被液包被96孔板,于4℃放置過夜,棄去孔內(nèi)液體并用200μL含0.1%BSA的PBS(pH7.4,0.01mol/L)洗滌3次;每孔加入200μL含2%BSA的PBS封閉,37℃孵育1h,使沒有結(jié)合的多余位點(diǎn)完全封閉,如上方法洗滌;將125I-OxLDL-Ab(96%,41.4PBq/mol)按倍比稀釋法配成系列濃度,分別與包被的抗原結(jié)合,反應(yīng)平衡后,如上方法洗滌。分別測(cè)各孔γ計(jì)數(shù),為總結(jié)合(TB);測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)樣的放射性計(jì)數(shù)。非特異性結(jié)合(NSB)每孔加入500ng(100μL)OxLDL-Ab,置于37℃下孵育1h后洗滌,測(cè)γ計(jì)數(shù)。2結(jié)果與討論2.1ph對(duì)標(biāo)記率的影響固定OxLDL-Ab為40μg、反應(yīng)液pH7.4、反應(yīng)總體積為200μL,觀察125I的活度與OxLDL-Ab用量的配比對(duì)標(biāo)記率的影響,結(jié)果示于圖1。由圖1可以看出,當(dāng)125I的活度與OxLDL-Ab用量的配比為92.5GBq/g時(shí),標(biāo)記率最高,因此,選取125I的活度與OxLDL-Ab用量的配比范圍為37～185GBq/g。固定OxLDL-Ab用量為40μg、125I的用量為3.7MBq,分別加入pH為7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0的PB緩沖液,使反應(yīng)總體積為200μL,反應(yīng)8min,觀察緩沖液的pH對(duì)標(biāo)記的影響,結(jié)果示于圖2。由圖2可以看出,pH為7.4～7.8時(shí),標(biāo)記率較高,達(dá)到79%～81%,由于抗體溶解于pH7.4的PBS溶液,因此,選用pH7.4的緩沖體系。固定OxLDL-Ab為40μg、125I3.7MBq、pH7.4、總反應(yīng)體積200μL,分別于反應(yīng)開始后2、4、6、8、10、12、14、16和18min取樣,測(cè)定標(biāo)記率,結(jié)果示于圖3。由圖3可以看出,4min后反應(yīng)已基本達(dá)到平衡,延長反應(yīng)時(shí)間,標(biāo)記率沒有明顯提高,卻可能影響抗體的活性,因此控制反應(yīng)時(shí)間為4～10min。取Iodogen管,分別加入20、40、80、160和320μgOxLDL-Ab和18.5、37、74、148和296kBq125I,固定1.3節(jié)中的其它反應(yīng)條件,觀察OxLDL-Ab用量對(duì)標(biāo)記率的影響,結(jié)果示于圖4。由圖4可以看出,OxLDL-Ab的用量低于160μg時(shí)均可獲得較高的標(biāo)記率,>80%。2.2標(biāo)記液的洗脫曲線根據(jù)2.1節(jié)選擇最佳標(biāo)記條件為:125I活度與OxLDL-Ab的用量配比的比為37～185GBq/g、pH7.4～7.8、反應(yīng)時(shí)間4～10min、抗體用量20～160μg。在此條件下對(duì)OxLDL-Ab進(jìn)行125I的標(biāo)記。標(biāo)記液的洗脫曲線示于圖5。由圖5可以看出,洗脫后得兩峰,前者為標(biāo)記產(chǎn)物125I-OxLDL-Ab峰,后者為雜質(zhì)峰,對(duì)比Na125I溶液的洗脫曲線可知為游離碘峰。由此曲線計(jì)算得標(biāo)記率>80%。用紙色譜法分析標(biāo)記液,125I-OxLDL-Ab的Rf為0.0～0.2;雜質(zhì)的Rf>0.5,其中游離碘的Rf為0.6～0.9。據(jù)此計(jì)算得標(biāo)記率>80%,這與洗脫曲線分析結(jié)果一致;放化純度為95%;比活度為73.3GBq/g。2.31理鹽水、牛血清白蛋白和人血清三應(yīng)體125I-OxLDL-Ab在不同介質(zhì)中的體外穩(wěn)定性列于表1。由表1可以看出,標(biāo)記物在生理鹽水、牛血清白蛋白和人血清三種體系中,分別在4、10和37℃下放置72h,放化純度降低小于5%;各體系在4℃下放置96h后放化純度降低仍小于5%,且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于5%,因此125I-OxLDL-Ab的體外穩(wěn)定性良好,適宜在4℃冰箱中貯存。2.31標(biāo)記抗體與dl-ab的比例對(duì)scatchird進(jìn)行的影響用prism5.0生物做圖軟件做飽和曲線和Scatchard圖,結(jié)果示于圖6。對(duì)于一定數(shù)量的抗原KLH來說,其親和力是固定的,當(dāng)125I-OxLDL-Ab的濃度從零開始上升時(shí),125I-OxLDL-Ab-KLH復(fù)合物的量先是上升很快,后漸漸變慢,在加入標(biāo)記抗體的濃度達(dá)49.67pmol/L時(shí),絕大多數(shù)固定抗原被飽和;Scatchard圖呈線性(r2>0.95),說明125I-OxLDL-Ab與相應(yīng)抗原結(jié)合反應(yīng)的比例為1∶1。通過計(jì)算得Ka為10.6±1.3GL/mol,說明該標(biāo)記抗體與其抗原具有特異活性,親和力好(一般抗體-抗原的Ka為0.1～10GL/mol)。3體外as診斷試驗(yàn)125I-OxLDL-Ab的標(biāo)記率和放化純度高、