全基因表達(dá)譜在子宮內(nèi)膜容受中的應(yīng)用

全基因表達(dá)譜在子宮內(nèi)膜容受中的應(yīng)用

子宮內(nèi)膜的容受是指子宮內(nèi)膜位于允許定位、粘合和滲透的空間，改變膜間質(zhì)，并將胚胎放入床上。該過程依賴于胚胎與子宮內(nèi)膜同步發(fā)育,同時(shí)包含了多種精密而復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。近年來基因芯片(DNA芯片、DNA微陣列)技術(shù),是在生物信息學(xué)指導(dǎo)下,結(jié)合雜交技術(shù)、精密掃描技術(shù)以及計(jì)算機(jī)軟件分析,最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的存在、含量及變異等信息的快速檢測(cè)。它具有高通量、高速度、高靈敏度、高精確度的特點(diǎn),可對(duì)多個(gè)基因甚至全基因組進(jìn)行快速、全自動(dòng)及多參數(shù)同步分析。子宮內(nèi)膜自身的接受狀態(tài)和胚胎-子宮內(nèi)膜的相互作用過程為胚胎著床的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是生殖與避孕研究的焦點(diǎn),本文對(duì)兩個(gè)環(huán)節(jié)的基因表達(dá)譜研究進(jìn)展綜述如下。1子宮內(nèi)膜自我接受能力的遺傳因素1.1植入格局對(duì)多態(tài)性精子內(nèi)皮的基因文庫是否有效檢測(cè)Kao等通過對(duì)植入窗口期(LH+8～10)與增殖晚期(d8～10)活檢標(biāo)本全基因表達(dá)譜進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)有156個(gè)基因上調(diào)而377個(gè)基因下調(diào)2倍以上。上調(diào)基因包括載脂蛋白、磷脂酶A2、mammaglobin、骨橋蛋白(osteopontin)、glycodelin、N-乙酰-6-硫轉(zhuǎn)移酶、b-TGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑成員、IGF系統(tǒng)、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑成員、多種免疫調(diào)節(jié)子、抗菌調(diào)節(jié)子及金屬硫蛋白等。下調(diào)基因包括腸三葉草因子、tenascinC、matrilysin(matrixmetalloproteinase-7)、卷曲相關(guān)蛋白(FRP-HE和Wnt抑制子)等。Borthwick等對(duì)植入窗口期(LH+6～8)與增殖晚期(d9～11)標(biāo)本全基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析,試驗(yàn)方法稍有不同,將樣本RNA雜交到芯片之前匯集混合,而Kao等是將單個(gè)體子宮內(nèi)膜標(biāo)本RNA分別雜交到芯片上獲得個(gè)體資料后再將資料匯總分析。Borthwick等發(fā)現(xiàn)有90個(gè)基因上調(diào)而46個(gè)基因下調(diào)2倍以上,其中許多基因和KAO等報(bào)道一致。Carson等使用Affymetrix芯片研究比較了黃體中期(容受期LH+6～8天)與黃體早期(容受前期LH+2～4)的子宮內(nèi)膜基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)323個(gè)基因上調(diào)而370個(gè)基因下調(diào)2倍以上。許多調(diào)節(jié)基因與Kao等報(bào)道相同,這些基因20%編碼細(xì)胞表面受體、黏附因子、ECM蛋白和生長(zhǎng)因子等。Riesewijk等也進(jìn)行了相似研究,采集設(shè)定了嚴(yán)格的取樣日期,且活檢樣本來自同一個(gè)個(gè)體LH+2和LH+7的子宮內(nèi)膜,報(bào)道有153個(gè)基因上調(diào),而58個(gè)基因下調(diào)3倍以上。其中約1/3的上調(diào)基因與KAO資料一致,而與CARSON相同的僅10%。Mirkin等采用不同的對(duì)照個(gè)體,嚴(yán)格取樣日期的程序,分析了植入窗口期(LH+3)和增殖晚期(LH+8)的子宮內(nèi)膜標(biāo)本,結(jié)果有90個(gè)基因上調(diào)而46個(gè)下調(diào)2倍以上,其中45個(gè)基因?yàn)樾掳l(fā)現(xiàn)的植入關(guān)聯(lián)基因。同一課題研究使用同一種芯片進(jìn)行,卻有不同結(jié)論,可能存在以下原因:①由于芯片價(jià)格昂貴,每項(xiàng)研究受試者僅3～10人,且研究對(duì)象的年齡、孕產(chǎn)史、生活環(huán)境存在較大差異。Riesewijk等為了避免上述差異,采用個(gè)體自身對(duì)照,但Mirkin等認(rèn)為此舉有涉嫌兩次活檢造成子宮內(nèi)膜炎性狀態(tài)。②取材時(shí)間存在差異。③標(biāo)本成批檢測(cè)與各自單獨(dú)檢測(cè)的差異。④設(shè)定的判斷域值存在差異,造成假陰性和假陽性結(jié)果。⑤芯片檢測(cè)的系統(tǒng)誤差以及無法克服表達(dá)差異。盡管報(bào)道存在分歧,且每篇報(bào)道都有新的發(fā)現(xiàn)和矛盾,但目前采用Affymetrix公司芯片最完整的5份研究中,共同認(rèn)定的植入窗口期標(biāo)志性基因見表1。1.2基因組織及基因家族的調(diào)節(jié)作用檢測(cè)在人胚胎植入過程中,胎盤滋養(yǎng)層可侵入母體子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞部分,而基質(zhì)細(xì)胞脫膜化對(duì)胚胎成功植入是必不可少的,基質(zhì)細(xì)胞分化具有明顯的形態(tài)特征和特有的生物合成及分泌表型。排卵周期分泌晚期不論受孕與否,基質(zhì)細(xì)胞脫膜化開始獨(dú)立進(jìn)行。Popovici等于2000年首次采用DNA芯片技術(shù)體外檢測(cè)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的分化,雌二醇(E2)和黃體酮用藥后10天,1mmol/L8-溴-cAMP用藥48小時(shí),比較分離后脫膜化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與非脫膜化對(duì)照組基質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)胰島素受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、促卵泡生成素(FSH)受體、抑制素-激活素Ba亞單位、α抑制素、血管緊張素-腎素家族的部分成員以及腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡均可誘導(dǎo)配體表達(dá)上調(diào),同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了上調(diào)特異性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期因子家族成員和cAMP信號(hào)傳導(dǎo)成員等新的分化成員,證實(shí)了脫膜化過程中的許多作用因子,尤其是b轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-b)家族新成員在脫膜化過程中的上調(diào),神經(jīng)調(diào)質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達(dá)和許多免疫成分的表達(dá),其中許多成員是新發(fā)現(xiàn)的。隨后,有兩個(gè)研究組對(duì)基質(zhì)細(xì)胞脫膜化進(jìn)行了更大規(guī)模的研究,其中Brar等研究了近7000個(gè)基因的時(shí)間特異性表達(dá)和調(diào)控。用E2、黃體酮和8-溴-cAMP處理人蛻膜的纖維原細(xì)胞,在0、2、4、6、9、12和15天檢測(cè)基因的表達(dá),分析6918個(gè)基因,其中121個(gè)基因誘導(dǎo)表達(dá)水平增加2倍以上,110個(gè)基因表達(dá)下調(diào),并有50個(gè)雙向變化。這些動(dòng)態(tài)調(diào)控基因按照發(fā)揮功能的時(shí)間歸類為9種基因表達(dá)模式,基因被分為以下幾類:細(xì)胞和組織功能、細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)與調(diào)控、EST序列和功能未知類。作者發(fā)現(xiàn)蛻膜纖維原細(xì)胞脫膜化過程中,下列蛋白發(fā)生了明顯變化:涉及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、IGF家族成員、有絲分裂激活蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的早期誘導(dǎo)蛋白等。這些發(fā)現(xiàn)提示,在脫膜化過程中同時(shí)存在多個(gè)作用體系。許多基因在特定的功能組中表達(dá)會(huì)發(fā)生改變,相關(guān)功能中基因家族同時(shí)發(fā)生誘導(dǎo)和表達(dá)下調(diào)。在另外研究中,Tierney等使用Affymetrix的高通量寡芯片,體外研究經(jīng)8-溴-cAMP處理0、2、4、6、12、24和48小時(shí)后,人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞脫膜化的基因表達(dá),也發(fā)現(xiàn)脫膜化過程中基因和基因家族表達(dá)的改變,這種改變與子宮內(nèi)膜分泌型的轉(zhuǎn)化一致。兩個(gè)研究小組共同認(rèn)定的上調(diào)或下調(diào)基因,可能均參與了脫膜化過程。但在體外細(xì)胞培養(yǎng)的基因表達(dá)結(jié)果并不一定與體內(nèi)組織狀況一致。兩個(gè)研究都證實(shí)在基質(zhì)脫膜化時(shí)間進(jìn)程中基因表達(dá)的改變,以及在基質(zhì)細(xì)胞分化到脫膜化表型過程中多種作用過程的并存,揭示了在子宮內(nèi)膜周期和脫膜化中基質(zhì)的功能時(shí)序。2子宮內(nèi)和子宮內(nèi)之間的相互作用2.1人類正常組織中引物合成及基因家族在體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況的改變Cowan等使用絨毛癌BeWo細(xì)胞系與子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型,采用差異展示PCR方法,研究胚胎滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜相互作用,發(fā)現(xiàn)在BeWo細(xì)胞刺激過程中基因表達(dá)差異,基質(zhì)細(xì)胞與BeWo細(xì)胞體外共培養(yǎng)4小時(shí)后,Soares基因在脫膜化細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),該基因同樣在Tierney等基質(zhì)細(xì)胞脫膜化研究中得到證實(shí),結(jié)果表明胚胎滋養(yǎng)層可能加速基質(zhì)細(xì)胞的脫膜化,提示胚胎滋養(yǎng)層對(duì)子宮內(nèi)膜的容受性有重要影響。Aronow等體外研究細(xì)胞滋養(yǎng)層到合胞滋養(yǎng)層基因的變化,通過6天的體外培養(yǎng),應(yīng)用寡核苷酸微列陣發(fā)現(xiàn)許多基因和基因家族的程序化改變,其中141個(gè)基因表達(dá)上調(diào),256個(gè)基因表達(dá)下調(diào),早期表達(dá)的基因主要與胚胎向母體的侵入功能有關(guān),合胞滋養(yǎng)期主要反映細(xì)胞孕期的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。該研究為體內(nèi)胚胎與子宮內(nèi)膜相互作用的研究提供了依據(jù)。最近Popovici等使用7～9周流產(chǎn)胎兒胎盤細(xì)胞體外與子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)建立模型,采用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)共培養(yǎng)后子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)171個(gè)基因表達(dá)上調(diào),119個(gè)基因表達(dá)下調(diào),并對(duì)其中MMP-11、TIMP3、DKK-1、IGFBP-1、PTX3、RPL19、FGF-1SOX4、IL-8基因進(jìn)行PCR定量印證。Chen等采用DNA芯片分析了人類早孕期的蛻膜和絨毛,發(fā)現(xiàn)641個(gè)基因在蛻膜和絨毛組織均大量表達(dá),這些基因可能參與了胎盤和脫膜間的相互作用。49個(gè)基因在脫膜中特異上調(diào),包括接合組織生長(zhǎng)因子、IGFBP-1、IGFBP-4、cathespinL、IL-1I型受體、胰島素受體、S-100鈣結(jié)合蛋白等,上述結(jié)論與他人研究一致。75個(gè)基因在絨毛特異表達(dá),包括抑制素Ba亞單位、stromelysin-3、糖蛋白a鏈前體、生長(zhǎng)激素變體、白血病抑制因子受體和其他細(xì)胞生長(zhǎng)周期調(diào)節(jié)因子、凋亡相關(guān)因子、激素、細(xì)胞因子、應(yīng)激效應(yīng)因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。這些研究有利于揭示早期胚胎和蛻膜相互作用時(shí)序和基因動(dòng)態(tài)變化。2.2不同植入點(diǎn)間的基因表達(dá)差異胚胎的植入是局部子宮內(nèi)膜的短暫系列反應(yīng),除了掌握子宮的整體容受狀態(tài)外,了解胚胎與子宮局部的識(shí)別融合機(jī)制,是對(duì)子宮內(nèi)膜容受性更深入直接的探索,但鑒于取材困難,研究只能用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。根據(jù)小鼠生殖規(guī)律,植入發(fā)生在第4天(陰栓日為第0天)。Yoshioka等用寡核苷酸微列陣研究了胚胎植入前(第3.5天)和胚胎植入后(第5.0天)基因表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)在此進(jìn)程中192個(gè)基因上調(diào),207個(gè)基因下調(diào)。因?yàn)榈?天時(shí)脫膜化明顯增強(qiáng),故這些基因多代表脫膜化,而非植入特異基因。許多基因變化與Cheon等報(bào)道黃體酮基因調(diào)節(jié)一致。Reese等用微列陣方法,分別在小鼠胚胎植入點(diǎn)和非植入點(diǎn)、黃體酮處理的延遲植入期和雌激素終止處理后的基因表達(dá)差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胚胎植入點(diǎn)36個(gè)基因上調(diào)和27個(gè)基因下調(diào),在黃體酮延遲植入期128基因上調(diào)和101基因下調(diào)。綜合分析發(fā)現(xiàn),27個(gè)涉及細(xì)胞分化功能的基因在植入點(diǎn)和子宮激活期同時(shí)上調(diào)。而下調(diào)的基因大多涉及宿主的免疫反應(yīng),說明這些基因在調(diào)節(jié)子宮對(duì)滋養(yǎng)胚植入環(huán)境的重要性。Salamonsen等采用差異顯示PCR研究發(fā)現(xiàn),剪接因子SC35、鈣結(jié)合蛋白D9k、單克隆非特異抑制因子(MNSF-B)表達(dá)差異。SC35主要作用于從mRNA前體中去除內(nèi)含子在植入點(diǎn)上調(diào),相反,雖然黃體酮使上皮細(xì)胞表達(dá)上調(diào),但在孕4.5～5.5天植入點(diǎn)卻表達(dá)明顯較低,免疫調(diào)節(jié)因子MNSF-B在植入期表現(xiàn)明顯下調(diào),上述結(jié)果與Reese等報(bào)道一致。更令人振奮的是Luu等利用了這一成果,通過阻斷鈣結(jié)合蛋白成功地在小鼠體內(nèi)達(dá)到阻斷植入的“避孕”效果。胚胎成功植入的進(jìn)程,需要胚胎和子宮內(nèi)膜同步發(fā)育,發(fā)生在特定的微環(huán)境狀態(tài),需要特定的時(shí)空及方式。現(xiàn)有的研究?jī)H證實(shí)了該進(jìn)程的框架。研究胚胎與子宮內(nèi)膜相互作用,雖然基于植入窗口期子宮內(nèi)膜的基因表達(dá),但人子宮內(nèi)膜活檢標(biāo)本只代表沒有胚胎影響下的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本,不能反映出胚胎植入過程中胚胎與子宮內(nèi)膜間的動(dòng)態(tài)交流過程。揭示了植入窗口期的一些分子通路、分子信號(hào)和生理進(jìn)程,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為我們提供可控的環(huán)境和